本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。

然而，影响ELISA试验结果的因素很多，故加强各个环节的质量保证才能充分发挥其方法学的优点。

ELISA试剂盒的操作方法

双抗体夹心法

1.包被:用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。在每个板的反应孔中加0.1ml，4℃ 过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。

2. 加样:加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃ 孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

3. 加酶标抗体:于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃ 孵育0.5~1小时，洗涤。

4. 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10~30分钟。

5. 终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6. 结果判定:可于白色背景上，直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以"+"、"-"号表示。也可测OD值:在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

间接法

1.用包被缓冲液将已知抗原稀释至1~10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜;

2.次日洗涤3次;

3.加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤;

4.(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml;

5.37℃孵育35-60分钟，洗涤;

6.'后一遍用DDW洗涤。

其余步骤同"双抗体夹心法"的4、5、6。

ELISA试剂盒试验的注意事项

1、要保证移液枪的准确性，误差不能超过2%。可用水和电子天平进行确定。但需要有专业人员进行矫正。
2、要配备20ul、50ul、100ul、1000ul和排枪各一支。吸取不同的液体后，要更换枪头。即使是吸取标准品时。
3、要在实验前1小时将试剂盒从冰箱中取出，使各种试剂都恢复到室温，以使结果更稳定。
4、实验时，要使底物避光保存。
5、用枪吸取液体时速度不能太快，以免产生气泡而使吸取量不准确。
6、吸取液体时，要用量程和需要量接近的枪去吸，减少误差。
7、将液体加到酶标孔中时，避免枪头和孔内液体接触，可使枪头上的液滴和孔壁接触，液滴会自然流下去。
8、液体全部加完后，可将酶标板在桌子上平行轻轻晃动30秒，混匀液体。也可以用酶标仪的晃动功能。
9、温浴时，要用不干胶或胶带纸封好酶标板，防止水分的蒸发。
10、洗板时，每次洗液加入后，应静置1分钟，使清洗更加*。没有洗板机时，倒去液体后，要将酶标板在报纸或毛纸上用力拍干。
11、洗液不够时，可用蒸馏水自行配制PH7.4，0.02M的磷酸缓冲液，加入0.1%的吐温20作为洗液。加入1/1000的叠氮钠后可长期保存。
12、底物是光敏感的，要在临用前现配。
13、检测前，要打开酶标仪，使之稳定10分钟以上。
14、底物有一定的毒性，终止液对皮肤有腐蚀性，应尽量避免接触。
15、待检样品要澄清，否则会影响结果。
16、温浴时间应遵守试剂盒规定。
17、应尽量做双孔实验，这样才能保证数据的准确性。
18、对结果有疑问的样品要用其它方法进行确证。