Pikogreen荧光染料使用方法
时间：2018-05-25 阅读：2500
使用方法
1. PikoGreen工作液的配制
使用前将PikoGreen dsDNA定量试剂回温至室温；PikoGreen是以100µL 200×的浓缩液形式保存于无水DMSO中的（共10管），实验当天，根据实验需求用1×TE按1:200 的比例稀释适量定量试剂浓缩液。例如要准备足够的操作溶液以2ml检测体系测定20个样品，可向19.9mL 1×TE 中加入100μL PikoGreen dsDNA 定量试剂。工作液见光易降解，尽量在配好后几小时内使用。
2. 配制标准品DNA溶液
1) 用1 X TE溶液溶解dsDNA制备1μg/mL dsDNA 。根据在1cm 光程长度的比色杯中A260nm时的吸光度确定DNA 浓度；相应于1μg/mLdsDNA 溶液A260=0.02。标准液常用小牛胸腺DNA制备，PikoGreen 试剂测定法在通常污染核酸制剂的几种复合物存在的条件下仍能保持线性良好，但是，为了得到有效的对照处理，被用来做标准曲线的dsDNA 溶液要用和实验样品相同的方式来处理，并且应该包含相同的可能存在的污染物。
2) 制备从0.5ng/mL 到500ng/mL（见表1）单重复8 个点的标准曲线。配制一系列的标准DNA 溶液，然后与等体积的PikoGreen 工作液混和，放入1 x 1cm 比色杯中。混合相同体积的1 x TE 和PikoGreen 操作溶液作为空白对照,避光于室温下放置2-5 分钟。
表1: 用1 x 1cm 比色杯时DNA 标准浓度配制参考
标准DNA 溶液浓度（ng/mL） | 标准DNA 溶液体积（mL） | PikoGreen 工作液体积（mL） | 标准DNA 终浓度(ng/mL) |
1000 | 1 | 1 | 500 |
200 | 1 | 1 | 100 |
50 | 1 | 1 | 25 |
20 | 1 | 1 | 10 |
5 | 1 | 1 | 2.5 |
2 | 1 | 1 | 1 |
1 | 1 | 1 | 0.5 |
0 | 1 | 1 | 空白 |
3) 当用微量检测皿适配器时，PikoGreen 测定也可在较低的测定体积（50μL 到200μL）内完成。产生从1ng/mL 到100ng/mL（见表2）的标准曲线，配制一系列的标准DNA 溶液，然后与等体积的PikoGreen 工作液混和，将至少50μL 溶液转移到微量检测皿中。确信不要在样品中引入气泡，轻轻地弹微量检测皿的外部经常可以驱散气泡。避光于室温下放置2-5 分钟。
表2：用微量检测皿DNA 标准浓配制参考
标准DNA 溶液浓度（ng/mL） | 标准DNA 溶液体积（mL） | PikoGreen 工作液体积（mL） | 标准DNA 终浓度(ng/mL) |
200 | 30 | 30 | 100 |
50 | 30 | 30 | 25 |
20 | 30 | 30 | 10 |
5 | 30 | 30 | 2.5 |
2 | 30 | 30 | 1 |
0 | 30 | 30 | 空白 |
4) 孵育后用合适的荧光计测量样品荧光值。Ex/Em=480nm/520nm，为了减少光漂白，应保持所有样品的检测时间一致。用荧光值zui大的样品校正仪器。
5) 用检测数据与DNA标准溶液浓度做回归分析，制作标准曲线。
3. 样品分析
1) 用1 x TE 稀释待测DNA 样品至需要的体积（1x1cm 比色杯需1.0mL，微量检测皿需25-100μL）。对样品高度稀释可以确保任何污染物都被zui大限度地冲淡。然而，也要避免取样体积太小而无法吸取的情况。
2) 在每个样品中加入等体积PikoGreen 工作液，混合好，将混合物移入合适的比色杯，避光于室温下放置2-5 分钟。
3) 检测、读取荧光值，换算样品中dsDNA浓度。可以对样品进行不同的稀释处理重复测定以确保结果的准确性。