1、本试剂盒货号：D3030L1411如何保存？

    室温保存，无需低温保存。

2、本试本剂盒货号：D3030L1411能否分离纯化200-1000nm直径的囊泡吗？

    不能，本试剂盒不能用于直径大于200nm囊泡的分离。

3、本试剂盒货号：D3030L1411适用于哪些种类样品中的外泌体提取？

    除细胞上清液外，本试剂盒还可用于尿液及其他低密度体液（如脑脊液、腹水、羊水、乳汁、唾液等）的外泌体提取。

4、本试剂盒货号：D3030L1411提取过程会用到哪些仪器和耗材？

    低温高速离心机、涡旋振荡器（Vortex）、水浴锅、移液器、离心管（1.5mL、50mL）。

5、样品在提取外泌体之前是否可以低温保存？

     可以。长期请保存于-80℃，无须加冻存液；短期（1-2天内）则保存于4℃即可。

6、粘度过大的样品如何处理？

    如果样品粘度过大时（因细胞分泌物较多所致），可将样品用1×PBS缓冲液进行等体积稀释，混匀稀释后的样品再使用本试剂盒提取外泌体。

7、培养细胞时，如何去除血清来源的外泌体？

    多数情况下，细胞在体外培时养需要血清，而血清中一般都含有外泌体，为避免血清对细胞外泌体的污染，可采用以下两种方法：

（1）  将细胞培养用的血清通过1×105g超速离心10h以去除血清外泌体；

（2）  选择无血清培养基进行细胞培养。

8、无外泌体血清培养基（或者无血清培养基）在什么时候使用？

    细胞在正常含血清的培养基中培养一定的时间后，细胞融合度约为60%-70%时，移去原有含血清的培养基，换成新鲜的无外泌体血清培养基（或者无血清培养基），继续培养24-48h，细胞融合度达到80%-95%左右时收取上清,该上清液即可用于提取外泌体。

9、细胞培养过程中的死细胞是否会影响外泌体的提取？

    会的。在收获细胞时，应确定死亡细胞占比不超过5%。细胞凋亡/死亡过程中会释放大量大小不等的囊泡，它们在外泌体的提取纯化过程中会污染活细胞产生的外泌体，同时有可能会堵塞EPF纯化柱。

10、准备做细胞外泌体Small RNA的NGS测序，初始样品量需要准备多少？

    普通肿瘤细胞系推荐使用40mL以上的初始样品量。由于某些细胞（如悬浮细胞、干细胞、神经细胞等）中外泌体含量比较低，建议先通过10kD超滤柱浓缩，准备40mL以上的浓缩液再使用本试剂盒提取外泌体。

11、加了ECS液离心之后无沉淀，这个现象正常吗？

    由于某些细胞（如悬浮细胞、干细胞、神经细胞等）中外泌体含量比较低，加了ECS液离心之后肉眼可能无法观察到沉淀，在重悬时使用PBS液朝离心管离心外侧的内壁反复吹打洗脱即可（避免剧烈吹打）。针对提取后的外泌体先进行NTA粒径检测或BCA蛋白定量检测，再决定是否进行后继实验。

12、在纯化过程中，EPF柱为什么会出现堵塞现象？

      该现象有可能是因为细胞培养时间过长产生很多细胞碎片(样品离心预处理时不充分，仍有细胞碎片残留)，建议细胞培养24-48h左右收集上清液。

13、EPF柱是否可以多次使用？

    不能重复使用。过量的样品会超出纯化柱的使用极限，影响分离效果。

14、外泌体如何保存？

    纯化后的外泌体可于4℃保存不超过一周，-80℃条件下可长期保存。

15、如何鉴定提取的外泌体？

    通常使用透射电镜检测（形态）、粒径检测（大小）、Western blot检测等方法鉴定提取的外泌体。在进行Western blot检测时，通常检测外泌体标志蛋白（CD63、CD9、CD81、TSG101等）。

16、提取的外泌体进行Western blot前是否需要加入RIPA试剂裂解？

    需要，一般按照1:1的比例加入RIPA试剂。

17、进行外泌体Western blot鉴定时有无内参蛋白可供选择？

      无，该检测属于定性检测。                              

18、组织细胞外泌体如何提取？

    无菌环境下将组织剪成小块（越小越好），然后在无血清的培养基中培养12h；将培养液转移至离心管中，于4℃以3000g离心20 min去除培养液中杂质和细胞碎片，将上清液转移至新的离心管中；先使用0.45μm滤器过滤上清液，接着使用0.2μm滤器过滤上清液，再按照本试剂盒说明书提取外泌体。