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实验干货|蛋白质浓度测定之BCA法的技巧

时间:2024-12-20      阅读:87

BCA法是Lowry法的一种改进方法。与Lowery法相比,BCA法操作起来更加简单方便,其试剂及其形成的颜色络合物稳定性更好,几乎不受其他干扰物的影响,并且灵敏度高(微量检测可达到0.5ug/ml),应用起来更加灵活。BCA法与Bradford法相比,BCA法的显著优点是不受去垢剂(SDS,Triton X-100,Tween-20等)的影响。

BCA法实验的原理

BCA是一种稳定的碱性水溶性复合物。在碱性条件下,蛋白质将Cu2+还原为Cu+,Cu+与BCA Reagent A(含有BCA)相互作用产生敏感的颜色反应,形成紫色的络合物。该水溶性的复合物在A562 nm处显示强烈的吸光性,吸光度和蛋白质浓度在广泛范围内有良好的线性关系,根据吸光值可以推算出蛋白浓度。

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BCA实验物资与设备

✔ 物资清单

1. BCA试剂盒:通常包含BCA溶液A与B,使用前需按比例混合均匀。

2. 蛋白质标准品:一般采用牛血清白蛋白(BSA)作为标准蛋白,用于绘制标准曲线。

3. 比色皿:可选用96孔板或其他规格,用于盛放样品并进行光度测量。

4. 离心管:用于样品的制备与储存。

5. 移液器及配套吸头:用于精确量取与添加不同体积的液体。

6. 去离子水:用于配制溶液与稀释样品

✔ 设备介绍

光谱光度计:在BCA法测定蛋白质浓度的过程中,光谱光度计是需要的仪器,它用于测量样品在特定波长(562纳米)下的吸光度。在选择光谱光度计时,应关注以下几点:

 • 精确度:仪器必须能够精确读取至0.001吸光单位的变化。

 • 波长范围:确保设备能够覆盖所需的测试波长,特别是BCA法所需的562纳米。

 • 处理能力:根据实验规模,选择具有合适读取速度与样品处理能力的光度计,如单孔至多孔板光度计。

BCA实验操作步骤

一、微孔板检测

① BCA工作液配制。根据标准品和样品数量,按50体积BCA 试剂A加1体积BCA 试剂 B(50:1)配制适量BCA工作液,充分混匀。

② 标准曲线绘制。取一块酶标板(酶标板的板底是不能用手去触碰的,一般拿的是侧壁),按下表数据加入试剂:

③ 样品准备:将待测蛋白样品用去离子水稀释至适当浓度,取20 ul样品,加入200 ul BCA工作液(蛋白液:工作液=1:20)。加样时枪要轻柔吹打,将其中液体混匀。

④ 振荡混匀后,37℃放置20 ~ 30 min。冷却至室温。颜色变化如下图:

⑤ 用酶标仪测定A562 nm处的吸光值,以不含BSA的吸光值为空白对照。

⑥ 以蛋白含量(ug)为横坐标,吸光值为纵坐标,绘出标准曲线。

⑦ 根据测得的吸光值,在标准曲线上即可计算出样品的蛋白含量。

⑧ 计算蛋白浓度:以查得的蛋白含量除以样品体积20 ul,再乘以相应的稀释倍数即可得到待测样品的实际浓度。

二、微孔板检测

① BCA工作液配制。根据标准品和样品数量,按 50 体积BCA Reagent A加1体积BCA Reagent B(50:1)配制适量BCA工作液,充分混匀。

② 选取7支洁净试管,其中6支标号1~6号管(包含第1支空白管),另外1支标记待测管。按照下表用移液器准确移取相应的标准蛋白溶液或待测样品、蒸馏水和BCA工作液于试管中。

③ 取适量体积的标准蛋白(根据情况用去离子水适度稀释),以蛋白液:工作液=1:20 的比例混匀。37 ℃ 温浴 30 min。冷却至室温。

④ 然后吸取各试管中的溶液于比色皿中并用分光光度计的562nm波长比色测定吸光度值。

BCA实验注意事项

 • 为保证蛋白浓度测量的准确性,最好做3个复孔,必要时剔除离群值。

 •  BCA法测蛋白浓度易受时间及温度的影响,所以最好每次测定都做标准曲线。

 • 加样时一定要准确加样且尽可能避免气泡产生,以免影响测量(加样结束可以用注射器戳破气泡,并将96孔板放在摇床上混匀片刻,以使样品与工作液充分接触)。

 • 孵育结束应尽快检测吸光度,并尽可能加快检测速度,以免带来误差。


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