Quick Cell 发光法支原体检测试剂盒

产品描述

《Quick Cell发光法支原体检测试剂盒》通过检测支原体的特异性酶活性以达到检测体外培养的哺乳动物细胞是否被支原体污染的目的。在支原体裂解后，该支原体特异性的酶，在底物存在下，具有将ADP转化成ATP的功能。由于荧光素酶（Luciferase）催化底物荧光素（Luciferin）产生光的反应需要ATP的参与，支原体特异性酶催化产生的ATP含量，可以通过该反应转化成生物发光（Bioluminescence）信号，该信号可以使用专门的发光检测仪（Luminometer）或具有发光检测功能的多功能酶标仪进行检测，发光的强度与ATP的含量成正比。通过比较细胞培养上清和未用于细胞培养的培养液上清二者的支原体特异性酶的含量，即可知道培养的细胞是否被支原体污染。反应原理如下：

使用方法

1、检测试剂的准备

产品从-80 ℃冰箱取出，在冰上操作，*次使用，分别用2.5 mL支原体检测溶液溶解试剂A和试剂B, 按每管50 μL可分别分装到50个1.5 mL离心管中，根据待检测的样品数量及阴性对照数量确定A,B试剂的用量（不用的试剂放置于-80 ℃冰箱低温保存，随用随取）。试剂A和试剂B，放室温5分钟左右（注意：不能加热），等其熔解后放冰上待用。

 注意：试剂A和试剂B只能在每次检测之前从-80 ℃冰箱取出的，熔解后在室温放置的时间尽可能的短，不能超过20分钟。熔解后，放冰上的时间也不能超2小时。已经融化后的试剂A和试剂B不能再次冻存使用。

2、阴性对照的设置

本试剂盒每次检测都必须设置阴性对照。阴性对照除了没有培养细胞外其他成分*相同，包括其中的血清批次、含量，抗生素等含量也必须*相同。阴性对照配制完后放于4℃冰箱。

3、待测样品的准备

为了准确判断细胞是否有支原体的污染，。具体操作如下（请严格按照相应的体积进行操作）：

（1）贴壁细胞待测的细胞培养3天且汇合度在70-90%左右时，取180 μL培养液上清上，在普通台式离心机上200 g (大约1500 rpm )低速离心5 分钟，准确吸取离心后的上清120 μL到一个新的1.5 mL离心管内，丢弃含细胞沉淀的原有离心管。

悬浮培养的细胞需要在换液传代后，至少让细胞生长3天再取培养液进行检测。

注意：离心力要严格控制在200 g左右，该离心力下，哺乳动物细胞将被沉淀下来而支原体不会。更高的离心力将可能导致支原体也被离心下来，从而导致假阴性。而更低的离心力将可能导致哺乳动物细胞不能被离心沉淀下来，从而导致支原体经测时，哺乳动物细胞内的ATP也被释放到溶液中，从而导致假阳性。

（2）将含有120 μL上清的1.5 mL离心管，在台式离心机上16000 g (大约13000 rpm)高速离心3 分钟，弃去上清（约108 μL）注意：切勿让吸头碰到离心管底部，底部为可能含有支原体的沉淀。往离心管内，加入108 μ*期配好的阴性对照培养液，并上下吹吸10次，将可能含有支原体的沉淀吹打均匀。该样品用于后续的支原体检测。

注意：将培养液替换成阴性对照的培养液是为了排除一些细胞代谢产物对后续检测的可能干扰。

5、将熔解后的试剂A、试剂B、阴性对照和待测样品放在室温10分钟左右（注意：不能加热），以便其温度与室温相同，本试剂盒的*反应温度为18-30℃，必须确保室温不低于15℃。

注意：制备好的待测样品如果不是当天立即检测，放于-80℃冰箱保存，不得放于室温、4 ℃或-20 ℃冰箱，样品在-80℃可以保存一年左右；为了日后检测方便，应该同时冻存一些作为阴性对照的培养液。

6、吸取50 μL阴性对照和待测样品，分别放入不透明（白色或者黑色均可）的96孔板内，加入50 μL试剂A，室温反应15分钟。

7、加入50 μL试剂B，室温反应3分钟后，在多功能酶标仪或者发光检测仪（Luminometer）上，以仪器默认的参数进行发光值的检测，5分钟内，连续测5次阴性对照和待测样品的发光值，计算各自的平均值。

8、结果判断

计算待测样品的发光平均值与阴性对照的发光平均值的比值：

 ①如果比值>1.2，说明待测样品有支原体污染（阳性）。严重的污染该比值可以达到10以上。

 ②如果比值在1.1-1.2之间，说明待测样品可疑有支原体污染（可疑阳性）。该样品需要继续培养24-48小时后，重新检测。如果继续培养24-48小时后，重新检测的比值仍然在1.1-1.2之间，应该判为阴性。

 ③如果比值<1.1，说明待测样品无支原体污染（阴性）。

相关产品