Biotin TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit

产品描述
　　细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体 DNA 的降解，这是一个较普遍的现象。这种降解非常特异并有规律，所产生的不同长度的 DNA 的片段约为 180 bp-200 bp的整数倍，表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现特异的梯状 Ladder 图谱，Biotin TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit试剂盒采用TUNEL 法，应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 在凋亡细胞断裂DNA 的 3´-OH 末端催化掺入生*素(Biotin)标记的dUTP(Biotin-X-dUTP)。随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的Streptavidin (Streptavidin-HRP)特异结合，后在HRP的催化下通过DAB显色来显示凋亡细胞，从而可以通过普通光学显微镜观察并计数凋亡细胞。由于正常的或正在增值的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3´-OH 形成，很少能被染色。TUNEL 法可以选择性的对凋亡细胞直接进行原位检测， 而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的 DNA 链断裂的细胞，是一种更快速、直接的检测手段。
订购信息

产品组分

运输与保存
蓝冰运输。-20℃避光保存；组分 A、E、G 需避光保存，避免反复冻融。有效期见外包装。
【注】：组分 A、E、F、G 使用时请佩戴口罩、手套，接触皮肤，请立即用大量水冲洗。
实验材料（自备）
PBS 缓冲液（ pH～7.4）
4% 多聚甲醛in PBS
0.3% H2O2  in PBS（新鲜配制）
70%乙醇（自选）
脱蜡溶剂（石蜡切片样本）
操作步骤

1. 样本准备：
    细胞样品
   （1）可选：准备一份阴性对照样本（加入不含TdT酶的TUNEL 反应液）。
   （2）PBS 清洗细胞两次。
   （3）细胞固定：加入适量 4%多聚甲醛(pH 7.4)溶液， 4℃ 放置 30 min。
   （4）PBS清洗细胞两次。
   （5）通透细胞：加入冰上预冷的 70%乙醇，在-20℃孵育 4 h。细胞能在 70%乙醇中-20℃的条件下保存一周。或者细胞可用配制于 PBS 中的 0.2% Triton X-100 溶液通透，室温放置 20 min。
   （6）PBS 清洗细胞两次。
   （7）封闭细胞：每孔加入100μL左右的配制于PBS中的0.3 % H2O2溶液，轻敲孔板使其充分覆盖细胞，室温避光封闭 30 min，用1×PBS清洗细胞2次。
   石蜡组织切片
   （1）室温下用二甲苯浸泡石蜡组织切片2次，每次5 min，以*脱掉石蜡。
   【注】：二甲苯有毒，易挥发，请在通风橱中进行此操作。
   （2）室温下，将切片样本浸没于无水乙醇中漂洗2次，每次5 min。
   （3）室温下，将切片样本连续浸没在不同浓度梯度的乙醇（95%、90%、80%、70%）中，每种浓度各漂洗1次，每次5 min。
   （4）室温下，将切片浸没于纯水中漂洗1次，每次3 min，再将切片浸没于1×PBS中漂洗1次，每次3 min，用滤纸小心吸干切片样本周围多余液体。
   （5）用免疫组化笔在切片样本周围描绘样品轮廓，以便下游通透与标记。
   （6）按1:100的比例，将2 mg/mL的Proteinase K溶液用1 × PBS稀释，使其终浓度为20 µg/mL。每个样本上滴加100 µL稀释好的Proteinase K溶液，使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育20 min（Proteinase K的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化）。
   【注】：蛋白酶K可以帮助渗透组织，但延长孵育时间可能导致切片脱落，所以要优化孵育时间长短。时间一般为10~30 min，4 µm左右的片子可以用10 min，但30 µm左右的可用30 min。过长易脱片、过短起不到通透效果。
   （7）PBS浸润清洗切片两次，每次5 min。
   （8）封闭：加入适量配制于 PBS 中的 0.3% H2O2溶液（新鲜配制），室温孵育 30 min，以灭活切片内源的过氧化氢酶。
   （9）PBS浸润清洗切片两次，每次5 min，用滤纸吸去多余的液体，将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。
   冰冻切片
   （1）将冰冻切片放置于室温的片架上，室温20 min，晾干。
   （2）将载玻片浸没在4%多聚*醛溶液（in PBS）中，室温固定30 min。
   （3）PBS 浸润清洗切片两次，每次5 min。
   （4）用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。
   （5）按1:100的比例， 将2 mg/mL的Proteinase K溶液用1 × PBS稀释， 使其终浓度为20 µg/mL。每个样本上滴加100 µL稀释好的Proteinase K溶液，使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育10 min（Proteinase K 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化）。
   【注】：蛋白酶K可以帮助渗透组织，但延长孵育时间可能导致切片脱落，所以要优化孵育时间长短。时间一般为10~30 min，4 µm左右的片子可以用10 min，但30 µm左右的可用30 min。过长易脱片、过短起不到通透效果。
   （6）PBS浸润清洗切片两次，每次5 min。
   （7）封闭：加入适量配制于 PBS 中的 0.3% H2O2溶液（新鲜配制），室温孵育30 min，以灭活切片内源的过氧化氢酶。
   （8）PBS清洗样品3次，每次5min，用滤纸吸去多余的液体，将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。
   阳性处理(仅阳性对照进行此步骤，其他样品直接进行TUNEL反应步骤)
   （1）按1:10的比例用diH2O将10 × DNase I Buffer稀释成1 × DNase I Buffer备用。
   （2）滴加100 µL 1 × DNase I Buffer到已通透的样本上，室温平衡5 min。
   （3）用1 × DNase I Buffer 以1:100稀释DNase I (2 U/μL)，使其为终浓度20 U/mL的工作液。
   （4）轻轻吸掉多余液体，加入100 μL浓度为20 U/mL DNase I工作液，室温孵育10 min。
   （5）轻轻吸掉多余液体，PBS清洗样品2次。
   2. TUNEL 反应：
   （1）配制TUNEL反应液（即用即配）。

（2）每个样品加入 50 μL TUNEL 反应液，37℃避光孵育 60 min，组织样本需要 2 h（阴性对照样品加入不含 TdT 酶的TUNEL 反应液）。
【注】：50μL TUNEL反应液适合涂片、切片或96孔板、48孔板、 24孔板或12孔板的一个孔，如果是6孔板中的一个孔TUNEL反应液建议使用100μL。如果待检测的样品为涂片、切片或在24 孔板、12孔板或6孔板中，建议在滴加TUNEL反应液后在样品上覆上防蒸发膜，防止TUNEL反应液蒸发，并且使TUNEL反应液均匀覆盖样品。
（3）PBS清洗反应后的样品3次，每次5 min。
3. Streptavidin-HRP工作液和DAB显色液的配制：
（1）Streptavidin-HRP工作液的配制（即用即配）：

（2）DAB 显色液的配制（即用即配）：

4. 样品显色：
（1）向样品滴加 50 μL Streptavidin-HRP 工作液，37℃避光孵育 30 min。 【注】：50 μL Streptavidin-HRP 工作液适合涂片、切片或 96 孔板、48 孔板、24 孔板或 12 孔板的一个孔，如果是 6 孔板，建议使用 100 μL。为防止 Streptavidin-HRP 工作液蒸发，建议在样品上覆上防蒸发膜。
（2）PBS 清洗样品 3 次，每次 5 min。
（3）向样品滴加 50 μL DAB 显色液，室温孵育 5-30 min 或在显微镜下根据颜色的发展情况掌握染色时间。 【注】：如果显色很强可短于 5 min 即停止显色，如果显色很弱，可以适当延长显色时间，甚至显色过夜。
（4）PBS 清洗样品 3 次，每次 5 min。
（5）选做：用苏*素染色液或甲基绿染色液进行细胞核染色。随后用 PBS 清洗 3 次。
（6）直接光学显微镜下观察。针对石蜡切片，如果需要封片，使用 95%乙醇脱水 5 min，再用 100%乙醇脱水 2 次，每次 3 min，再用二甲苯透明 2 次，每次 5 min。

注意事项
1. 该产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。
2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
3. die dan hua na对HRP有抑制作用，实验中请勿使用含有die dan hua na的试剂。
常见问题与分析