高脂样本甘油检测试剂盒（适用肝脏、脂肪细胞）

 描述：甘油是甘油三酯的水解产物。与游离脂肪酸一样，甘油含量是甘油三酯水解反应的可靠检测指标，但检测更加方便。本试剂盒采用优化步骤，能够检测实体组织、细胞中的甘油含量，线性范围为10-1200µmol/L。

 原理：在ATP存在下甘油被甘油激酶磷酸化为3-磷酸甘油，再被甘油磷酸氧化酶氧化产生过氧化氢；在过氧化物酶作用下生色底物转化为苯醌亚胺，其光密度值与甘油浓度成正比。

 适用范围：测定实体组织、细胞中的甘油浓度。

 组成 (105次微板测定或30次1 ml比色杯测定)：

(1)    裂解液 100 ml   

(2)    R1试剂 16 ml

(3)    R2试剂  4 ml    

(4)    4 mmol/L甘油标准品1 ml

4 ºC保存  6个月有效

 所需设备：酶标仪、生化分析仪或721、722型可见光分光光度计。佳工作波长550nm，如无此波长建议优先选用570nm、次选530、490nm。

 一 组织细胞裂解

细胞(包括分化的脂肪细胞)裂解：

消化、离心收集细胞。或直接在培养皿内裂解。通常6孔板单孔约2x10⁶个细胞，75cm²瓶约1x10⁷细胞。按比例每1~2 x 10⁶细胞加0.1ml裂解液，震荡或涡旋裂解后，静置10分钟。

 动物组织裂解：

切记要预先将新鲜组织剪切称重后再进行保存。组织冻存后再进行解冻、剪切、称重可能会产生严重的测量误差。离心管精确称重，加入组织块后再称重，二者相减(即减量称重法)计算组织重量(约100mg)。强烈建议按比例每1mg组织加10µl裂解液以减少样品间蛋白和脂质含量变异而产生的误差。（注意；裂解液用量在1ml或更多可保证有效的裂解与脂质提取）。用电动高速匀浆器或手动玻璃匀浆器破碎组织。（不超声方法，因其不能*和均匀破碎。应根据预实验调整初始的组织细胞加入量），而后，静置10分钟。

 二. 裂解液处理：

1.    取适量上清液转移到1.5ml离心管中，进行步骤2的操作。余下的裂解液可用BCA法蛋白定量试剂盒进行蛋白定量或－20ºC储存。

2.    70ºC 加热10分钟灭活脂肪酶，可能出现絮状沉淀。

3.    室温5000rpm离心5分钟，上层清液即可用于酶学测定。

三 工作溶液配制：按4:1比例，取4 ml试剂R1与1 ml试剂R2混合即可，立即使用或4ºC保存<1天，变色弃去。（注意：谨防来源不明但容易发生的甘油污染，可来自操作者本人或标准品液体微粒溅射等。）

四 标准品稀释：用蒸馏水、生理盐水或与样品缓冲液一致的液体，将4 mM甘油标准品倍比稀释为1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 µmol/L，通常取其中4~6管即可，注意设置0浓度对照反应管。

五 甘油测定

1.    参见下表加样。待测样品体积10µl，多加可能会抑制反应。

2.    37ºC或25ºC反应 10分钟。反应平衡后颜色在60分钟内稳定。

3.    先用蒸馏水+工作液的空白管调零，然后测定各管OD值。

4.    绘制标准曲线并计算甘油浓度。

附Excel作图步骤：各标准管OD值为y轴，标准品浓度为x轴。(1)鼠标左键圈住数据，点击做图向导，选择-散点图-，点击-完成-。(2)鼠标右键点图上的某一点，点击-添加趋势线-，点击-选项-，点击-显示公式-和-R²值-。

5.    以每mg蛋白浓度或细胞数校正甘油含量。

加样表（可对样品和工作液比例进行微量调整）

说明：

1. 维生素C>0.18g/L、血红蛋白>2g/L、胆红素>0.25g/L、二硫苏糖醇、巯基乙醇、高浓度EDTA干扰测试。

2. 红细胞糖酵解时合成磷酸甘油影响测定。