染料法和探针法RT-qPCR的优缺点比较
时间:2024-09-07 阅读:302
其原理是:在PCR反应体系中加入过量荧光染料,DNA扩增的过程中,荧光染料特异性地掺入DNA双链,发射荧光信号,随着反应的进行,荧光强度逐渐增强,并且可以实时测量。如果你要扩增你的目标样品40个循环,在最后一个循环结束时检测到的荧光会比在第10个循环测得的荧光强很多。
优点:
1、成本较低,适合大规模的实验。
2、在实验设计阶段非常省时,因为它只需要合适的引物设计。
缺点:
1、特异性不是很高。染料可以插入任何双链DNA,包括引物二聚物和非特异性产物。
2、如果引物二聚体存在或者产物受到污染,得到的结果会不可靠。3、更容易与低丰度的目标产生非特异性荧光。
需要更多的时间进行结果分析。
这种方法涉及使用荧光标记的寡核苷酸(短DNA分子),探针通常在5 '端和3 '端都被标记。
在探针的5’端有报告基团,3’端设计淬灭基团,当报告基团接近淬灭基团时,不会检测到荧光信号。RT-qPCR反应时,寡核苷酸两个基团分离,即可检测到荧光信号,并与PCR产物同步。
使用这种方法的荧光检测依赖于两个过程:1)引物与目标序列的结合(2)探针与引物下游
互补序列的结合。
优点:
1、更有可能只放大所需的产物,由于引物和探针的结合具有特异性。
2、不需要解离曲线,只有探针与正确的目的序列结合时才能检测到荧光。
3、由于具有特异性,数据更可靠。
4、数据分析时节省时间。
缺点:
1、需要大规模实验时耗费成本高。
2、需要更长的时间来设计实验,因为需要好的引物和探针。
总的来说,这两种荧光检测方法都很有效,但对于你的具体实验,可以选择适合的方法。