微尺度机械测试仪MicroSquisher凝胶支架比干细胞递送的构建
时间：2022-10-13 阅读：1262
抽象
致密胶原 （DC） 凝胶促进接种牙髓干细胞 （DPSC） 的成骨细胞分化，并在体外和皮下与生物活性玻璃颗粒结合时经历快速无细胞矿化。然而，DC生物活性玻璃混合凝胶在将DPSC输送用于骨质部位骨再生的潜力尚未得到研究。在这项研究中，无细胞和DPSC种子DC-S53P4生物活性玻璃的功效[（53）SiO2-（23）钠2氧-（20）曹（4）P2O5，wt%]杂交凝胶在临界大小的小鼠颅骨缺损中进行了研究。将骨刺激性生物活性玻璃S53P4掺入DC凝胶中，导致其在体外模拟体液（SBF）中加速无细胞矿化，其中在1天内检测到羟基碳化磷灰石。到SBF的第7天，微机械分析显示矿化凝胶的压缩模量增加了8倍。 生物活性玻璃对DC-S53P4中的人- DPSC的原位效应是显而易见的，因为它们在没有成骨补充剂的情况下成骨分化。在成骨培养基中培养时，碱性磷酸酶和I型胶原蛋白的产生进一步增加。DC-S53P4构建体的这种骨刺激作用在体内得到证实，植入8周后，无细胞支架和DPSC接种的DC-S53P4构建体均形成矿化和血管化的骨基质，具有成骨细胞和破骨细胞活性。然而，令人惊讶的是，体内显微CT分析证实，无细胞支架产生了更大体积的骨骼，在第3周已经可见，并且表现出*的小梁结构。这项研究的结果表明，DC-S53P4支架否定了干细胞递送有效骨组织再生的需要，并可能加速其临床应用。
2. 实验方法
DC-S53P4支架的生物活性和机械性能
如前所述，使用大久保的SBF研究了生物活性[31]。将DC和DC-S53P4支架以1：15 （mg/mL）DC/SBF比（即25 mL SBF）置于SBF中，并在6 h、第1、3和7天评估矿化程度，每3天更换一次溶液[10，11]。如上所述，进行了扫描电镜、透射电镜和XRD分析。在每个时间点使用微尺度机械测试仪（加拿大，cellscale，MicroSquisher）以100μm / s的压缩速度对湿水凝胶支架进行压缩机械测试（n = 5）。
MicroSquisher是一个微型机械测试系统，MicroTester细胞微压缩可以做别人所不能做之事。更小的标本，更好的解像力，更容易的测试设置和更好的视觉效果。应用包括小组织样品，水凝胶微球，细胞球体和工程化组织生长基质。为了适应所有用户的广泛应用，CellScale推出了两款MicroTester！
3. 结果
DC-S53P4脚手架的制造和表征
无细胞和细胞接种DC-S53P4凝胶支架表面形态的SEM显微照片证实了在纤维胶原基质结构中掺入生物活性玻璃颗粒（图1B）。将S53P4添加到DC表明胶原纤维与生物活性玻璃表面（图1B，I）和交织的细胞S53P4和胶原纤维结构（图1B，II）的结合。制造的无细胞直流支架的ATR-FTIR光谱（图1C）显示了在1643，1550和1243 cm处通过酰胺I，II和III带进行的特征性胶原蛋白键合−1分别为[11，12]。S53P4的光谱显示硅酸盐振动的存在，Si-O-Si在1000和1100厘米之间−1;与SiO的非桥接氧键−1在 900 厘米−1 [36];和生物活性玻璃内的大气碳酸盐，位于897和1400厘米处−1 [DC-S53P4支架的光谱显示了特征性的胶原酰胺I，II和III键，而生物活性玻璃的掺入掩盖了胶原侧链在1100-800 cm中的振动−1区域，而不是显示 Si-O-Si 和非桥接氧键与 SiO−1 [同样，S53P4光谱中存在的碳酸盐峰在杂交后再也无法观察到[11，37]。
3.2. 无细胞DC-S53P4支架在SBF中的矿化作用
在SBF中检查DC-S53P4杂交凝胶支架的无细胞生物活性长达7天。对DC-S53P4的SEM显微照片的定性研究表明，SBF中矿物的形成水平随时间的变化而增加（图2A）。相比之下，仅DC在SBF的7天内显示出矿物形成的证据很少（图。S1）。DC-S53P4 的 ATR-FTIR 光谱（图 2B）表明 v3 PO 的吸收带随时间变化增加43−在 1022 厘米−1， v4 采购订单43−在 560 和 600 厘米−1， v2 一氧化碳32−在 873 厘米−1和 v3 一氧化碳32−在 1460 厘米−1以及 v1 PO 的强化43−在 960 厘米−1，均提示HCA在胶原基质内的形成和生长[38]。此外，S53P4的XRD衍射图（图2C）显示出无定形玻璃的特征图案，而制造的DC-S53P4在约20°2 θ处表现出宽衍射图案，这归因于胶原纤维的随机取向[10]。在SBF中6小时后，这种无定形的宽衍射驼峰变得更小，不那么突出。随着浸泡时间的进一步延长，从第1天开始观察到与特征羟基磷灰石有关的峰（ICDD参考号009-432，图2D），这在更长的时间内变得更加明显。峰的增加和变窄不仅表明DC-S53P4支架内羟基磷灰石的增加，而且表明支架通过暴露于SBF从无定形结构到晶体结构的转变。相比之下，SBF中的直流脚手架（图1000）。S1）在ATR-FTIR光谱中未显示表明磷酸盐含量增加的峰，并且XRD模式仅显示第7天宽峰色散的轻微指示，类似于在SBF中6 h后DC-S53P4的模式。微机械压缩测试表明，在SBF的7天内，DC-S53P4的刚度增加了8倍（图3）。直流与S53P4杂交和SBF时间（p<0.0001和p<0.01）的压缩模量均有统计学意义增加，而仅直流支架的压缩模量随SBF浸泡时间的增加没有显著增加（p>0.05）。
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图 2.无细胞DC-S53P4支架在SBF中的矿化进展.（A） 在 SBF 中第 （I） 天、第 1 天 （II） 第 3 天和第 （III） 7 天时 DC-S53P4 的扫描电镜图像，（IV） 在第 7 天显示 DC-S53P4 的放大倍率较高。所有比例尺 = 5 μm。（B） 指纹区域的 ATR-FTIR 光谱，描绘了 DC-S53P4 在 SBF 中 7 天内的矿化情况。（C） SBF 中 DC-S53P4 的 XRD 图谱和 （D） 羟基磷灰石的参考 XRD 图谱 （ICDD 9–432）。无花果。S1 显示了超低频中直流的扫描电镜、反光栅光谱和 XRD。
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图 3.通过矿化改变脚手架机械性能。在 SBF 中 7 天内 （A） 直流和 （B） DC-S53P4 的代表性压应力-应变曲线。（C）直流和DC-S53P4中平均压缩模量随时间的变化在SBF中。根据学生 t 检验，误差线± SD 和 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。
3.3. HDPSCS在DC-S53P4中的代谢活性和活力，体外
为了验证DC-S53P4支架的细胞反应和成骨潜力，在对照和成骨培养基（分别为CM和OGM）中在支架中培养接种的hDPSC长达28天。在DC-S53P4中接种的hDPSC的代谢活性最初增加后，作为培养时间的函数略有减少（图4A）。在DC中接种并在CM中培养的hDPSC的代谢活性似乎在第7天达到峰值，随后随着培养时间的增加而降低。从第14天开始，观察到在所有条件下培养的细胞的代谢活性是稳定的。第7天的活/死分析证实CM和OGM中死细胞的存在最小（图4B）。第28天，通过使用Hoechst测定法（图4C）测量DNA来量化支架内的细胞数量，每个支架的细胞数量都在150，000至170，000个细胞之间，并且在CM和OGM中DC和DC-S53P4之间没有显着差异，表明所有支架中的平衡细胞数量。
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图 4.接种的hDPSC在DC和DC-S53P4支架中的代谢活性和活力。（A）接种在（I）DC和（II）DC-S53P4中的hDPSCs的代谢活性，如阿拉玛蓝®还原测定在对照（CM）和成骨培养基（OGM）中长达28天所示。（B）在第7天接种在DC-S53P4中的hDPSCs的活/死图像，分别在（I）CM和（II）OGM中用绿色和红色荧光指示活细胞和死细胞。比例尺 = 200 μm。（D）第28天存在的细胞数量，通过CM和OGM的赫希斯特33258 DNA测定进行定量。根据学生 t 检验，± SD 和 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001 和无显著性 （ns） > p 为 0.05。（为了解释此图例中对颜色的引用，读者请参阅本文的网络版本。
hDPSC种子DC-S53P4杂交支架的体外矿化和成骨分化
进行组织学分析以评估DC和DC-S53P4支架的细胞分散和矿化潜力。Masson的三色在所有条件下都显示出均匀的细胞在两个基质上的分散，而茜素红和Von Kossa染色表明，无论添加生物活性玻璃，当应用OGM时，钙和磷酸盐的沉积分别增加（图5A）。组织学分析证实了生物活性玻璃对矿化的影响，其中在无细胞DC-S53P4支架内观察到轻微的矿化迹象（图.S3）。
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图 5.hDPSC种子直流和DC-S53P4支架的矿化和成骨分化。将支架在对照组（CM）和成骨培养基（OGM）中培养，并在第28天使用组织学分析和蛋白质印迹进行评估。（A）马森三色，茜素红和冯·科萨的组织学染色。所有比例尺均为 100 μm。（B）ALP，I型胶原蛋白和β肌动蛋白的蛋白质印迹（3个独立实验）。（C）ALP和I型胶原蛋白的定量。数据以归一化为β肌动蛋白。根据学生 t 检验，SD 和 *p ±误差线< 0.05、**p < 0.01。（为了解释此图例中对颜色的引用，读者请参阅本文的网络版本。
蛋白质分析表明，当接种在DC-S53P4中并在OGM中培养时，细胞的ALP产量显着增加（p <0.001）（p <0.001）（图5B和C）。与所有其他条件相比，杂交DC-S53P4和OGM中hDPSC的培养也导致I型胶原蛋白产量显着增加（p <0.05）（图5B和C）。微机械压缩试验表明，在OGM培养时，支架压缩模量显著增加（p <0.001），但S53P4的存在没有显著影响（p = 0.37）（图中。S2）。
4. 结论
该研究提出了一种DC-S53P4生物活性玻璃混合水凝胶作为治疗临界大小骨缺损的合适支架。体外调查证实了这些DC-S53P4支架的快速矿化和骨刺激性质。此外，在植入无细胞支架和mDPSCs种子构建体的临界尺寸颅面缺陷中，在体内观察到具有组织胶原原纤维和血管网络的矿化骨基质。然而，新形成的骨的数量和质量在无细胞DC-S53P4支架中出现较大。虽然骨愈合的机制尚未确定，但DC-S53P4支架为骨组织工程提供了一种有希望的无细胞策略。
Mi
MT G2
压缩、拉伸、弯曲、压痕和剪切测试的测试模式
0.1μm分辨率的高精度压电执行器
可选双轴成像
解像力降至10nN
高分辨率的CCD成像
集成温控介质浴
功能齐全的用户界面软件，可进行实时反馈的简单、循环、松弛和多模式测试
Mi
MT LT
压缩、拉伸、弯曲和压痕测试的测试模式
适合测各种不同的应用，并且价格公道
1μm分辨率的高精度压步进马达
解像力降至10nN
高分辨率的CCD成像
集成温控介质浴
功能齐全的用户界面软件，可进行实时反馈的简单、循环、松弛和多模式测试
试样和安装
样品：300μm水凝胶微球（30KPa）
峰力：20mN
试样：20μm厚、4mm宽箔带（70MPa）
峰力：3mN
标本：直径2毫米的水凝胶圆柱体（12KPa）
峰力：20mN
样品：1.5mm直径压头压入水凝胶（2KPa）
峰力: 12mN
标本：蜘蛛丝
峰力：2mN
样品：3.5mm宽，1.5mm厚的水凝胶（0.5KPa）
峰力：1.4mN
视频
技术信息
| MTG2 | MTLT | |
| 外形尺寸 | 56 X 14 X 24cm | 52 X 17 X 21cm |
| 重量 | 9kg | 6.5kg |
| 力度大小 | 500mN | 500mN |
| 可用的力传感器 | 0.005, 0.02, 0.08, 0.2, 1, 5, 25, 100, 500mN | 0.005, 0.02, 0.08, 0.2, 1, 5, 25, 100, 500mN |
| 力的准确性 | 约换能器容量的0.2% | 约换能器容量的0.2% |
| 最大夹点分离 | 约10mm | 约10mm |
| 最大速度 | 5mm/s | 5mm/s |
| 最大循环频率 | 0.1Hz | 0.1Hz |
| 最大数据频率 | 5Hz | 5Hz |
| Actuator Technology | Piezo-electric Motor | Stepper Motor |
| Actuator Resolution | 0.1um | 1um |
| Range of Field of View | 0.4-11.0mm | 0.8-5.5mm |
| Vertical Image Resolution | 2048px | 1536px |
| Secondary Camera Option | Yes | No |
| Secondary Test Axis Option (Shear) | Yes | No |