题目：不同年龄软骨ECM对BMSC体外和体内软骨生成的影响

（如果需要完整文献请与我们工作人员联系，可试样）

1. 简介

基于细胞外基质（ECM）的生物材料通过模拟天然微环境来调节没有外源性生长因子的骨髓间充质干细胞（BMSC）的软骨分化，是软骨组织工程的有希望的候选者。ECM支架的生物学特性主要取决于原始来源，这将直接影响ECM材料的软骨作用。尽管近年来对ECM支架的研究不断扩大，但优化的ECM材料在软骨再生中的选择较少报道。在这项研究中，我们收获并比较了新生儿、幼年和成年兔的关节软骨ECM。结果表明，不同年龄ECM在脱细胞前后的机械强度、硫酸化糖胺聚糖和胶原蛋白含量存在显著差异。因此，三种基于ECM的胶原蛋白水凝胶显示出不同的组成和机械性能，它们发挥了年龄依赖性软骨诱导性。总的来说，体外和体内结果表明，新生儿ECM促进BMSCs的软骨形成最多，但导致严重的基质钙化。相比之下，BMSCs通过成人ECM合成了最少量的软骨基质，钙化最小。幼年ECM在促进BMSC软骨生成和预防基质钙化方面取得了总体效果。总之，这项研究为我们目前在设计未来基于ECM的生物材料以成功修复关节软骨方面的知识提供了重要信息。

2.材料和方法

机械评估

使用纳米压头确定每个样品的力学评估（Piuma，Optics11，荷兰）。有效杨氏模量通过数据拟合以下参数计算得出： 探头刚度 4.3 （N m−1);半径 51.0 μm。

机械测试

使用动态机械分析仪，在室温下测定胶原蛋白水凝胶和三种不同胶原蛋白-DCP复合水凝胶（Φ 8 mm×h 2.5 mm）的储存和损耗模量，并在多频模式（1-5 Hz）下测量其机械性能。

不同年龄兔天然软骨组织的比较

含水量和机械强度

首先比较了新生、幼年或成年兔的原生软骨组织的差异。3日龄兔软骨组织中的含水量（图1A）显著高于其他两个样品。100天和200天之间的含水量没有显着差异。有效杨氏模量测定的力学性能表明，软骨组织的机械强度随年龄的增长而增加，各组间差异均有统计学意义。

图1

表征来自新生儿、幼年或成年兔的天然软骨组织。（A）含水量（左）和机械强度（中）。（B）DNA，sGAG和总胶原蛋白含量（n = 3）。ns 表示 P > 0.05，* 表示 P < 0.05，** 表示 P < 0.01，*** 表示 P < 0.001。

DNA、sGAG 和总胶原蛋白的定量

通过定量DNA含量来评估新生、幼年或成年兔软骨组织中的细胞密度（图1B），其随着年龄的增长呈下降趋势。3天样本的DNA含量明显较高，为14 371 ng/mg±480 ng/mg，是其他两个样本的四倍多。100天样品中的DNA含量为3325 ±220 ng/mg，高于200天样品中的2588 ±410 ng/mg，但这种差异没有统计学意义。3个不同组的sGAG含量遵循相同的DNA趋势，在3天、100天和200天样品中分别为184.17±12.30、117.87±2.97和110.57±2.61 μg/mg。3 天样本中的 sGAG 值在统计学上高于其他两个样本，但 100 天和 200 天样本之间的差异没有统计学意义。相比之下，3组总胶原蛋白含量的DNA和sGAG值呈逆转趋势，其中200天样品的最高值为855.51±38.14 μg/mg，其次是100天样品中的753.53 ±27.69 μg/mg和3 d样品中的629.10 ± 19.68 μg/mg。值得注意的是，所有组间总胶原蛋白含量的差异具有统计学意义。

机械性能和降解

通过储能模量（图3B）和损耗模量（图3C）表征了水凝胶的力学性能，它们分别代表了水凝胶的弹性和粘度。一般来说，胶原蛋白水凝胶的储存量和损耗模量，并且随着DCP的掺入而增加。此外，随着老兔的DCPs的加入，复合水凝胶的存储模量和损耗模量均进一步增加。结果，四种水凝胶的总储存和损耗模量遵循胶原蛋白-200d>胶原蛋白-100d>胶原蛋白-3d>胶原蛋白的顺序。4种水凝胶在胶原酶溶液中的降解速率如图.3D所示。一般来说，胶原蛋白水凝胶具有较高的降解速率，在19 h内降解。相比之下，3种胶原蛋白-DCP复合水凝胶的降解曲线相似，24 h时胶原蛋白-3d、胶原蛋白-100d和胶原蛋白-200d水凝胶的降解率分别为95.56%、92.20%和93.07%。

讨论

当使用天然软骨组织作为原材料来制造ECM支架时，了解软骨组织的内在特性非常重要，因为这可以为进一步优化ECM材料的选择提供关键信息。本研究旨在表征新生、幼年或成年兔的脱细胞软骨ECM，以及它们在21天体外培养和28天体内植入中对BMSCs软骨分化和软骨ECM合成的影响。据我们所知，这是第一项直接比较由不同年龄的软骨组织制成的ECM支架的研究，以及不同年龄的去细胞化组织的内在特性如何影响ECM支架的特性，这进一步影响其软骨生成性能，以实现成功的软骨再生。我们的研究提出了几个值得注意的发现，即由三种不同年龄的软骨组织制成的ECM支架的软骨生成作用。结果表明，3个不同年龄软骨组织ECM支架的机械强度、sGAG和总胶原蛋白含量存在统计学差异，影响3个样品的细胞增殖和分化。详细的生化和基因分析表明，由较年轻的软骨组织制成的ECM支架导致BMSCs更好的软骨形成，但不幸的是，新生儿软骨组织也会导致不需要的组织钙化。

首先比较了新生（3天）、幼年（100天）和成年（200天）兔关节软骨组织的成分和力学差异。结果发现，3天软骨组织中的DNA和sGAG含量在统计学上高于100天和200天样品[26，27]。sGAG是带负电荷的多糖，可结合并保留水和水溶性分子[28]。因此，样本的sGAG含量与其含水量相关，在3 d样品中最高，并随年龄增长呈下降趋势[29]。相比之下，关节软骨中的总胶原蛋白含量随兔子年龄的增长而增加[30]。胶原蛋白是软骨组织中结构的大分子，主要抵抗应激[31]。因此，软骨组织的总胶原蛋白含量与机械强度一致，并随年龄增长呈增加趋势。去细胞化手术有效去除了不同年龄的所有软骨组织中99%以上的dsDNA，并且dsDNA浓度均低于<50ng/mg干重的临界脱细胞水平[10]。由于ECM中的sGAG通过弱分子间相互作用（例如非共价键）连接到胶原纤维网络[32]，这在脱细胞过程中很容易中断。因此，只有25-30%的sGAG在去细胞化后仍留在DCP中。相比之下，脱细胞后所有3个DCP的总胶原蛋白含量几乎保持不变，表明去细胞化过程不会导致胶原网络结构的降解或去除，并保留了软骨组织的基本结构。这些结果也与之前的研究一致[9，33]。3种不同年龄软骨组织的DCPs随年龄增长呈下降趋势，总胶原蛋白含量呈上升趋势。经过相同的研磨过程，具有较高机械强度的软骨组织导致软骨组织颗粒的晶粒尺寸较大。因此，3 天 DCP 最小，200 天 DCP 的晶粒尺寸最大。虽然大小差异不影响去细胞化的有效性，但它可能会影响DCP上的细胞附着和行为[34]。

3个ECM支架，分别命名为胶原蛋白-3d、胶原蛋白-100d和胶原蛋白-200d水凝胶，由不同年龄的胶原蛋白水凝胶和不同年龄的不同DCP混合制成。SEM图像表明，胶原蛋白网络在所有样品中都保存良好，单个DCP被困在胶原蛋白网络中。因此，单个胶原蛋白-DCP水凝胶的力学强度受添加DCP的影响，3个水凝胶的储存和损耗模量遵循胶原蛋白-200d>胶原蛋白-100d>胶原蛋白-3d的顺序。当用BMSCs培养时，额外的DCPs在体外也延迟了水凝胶的降解并减少了其收缩，并且在体外和体内均显示出BMSCs的软骨分化和sGAG合成在体外和体内的年龄依赖性性能。胶原蛋白-3d水凝胶实现的软骨形成最多，其次是胶原蛋白-100d，胶原蛋白-200d最少。这一发现证实了来自新生儿、幼年或成年兔的ECM支架会导致BMSCs产生不同的软骨诱导性。这可能是由于许多因素的组合。首先，由于较年轻样本中的sGAG浓度较高，更多的sGAG能够在来自年轻兔子的ECM支架中保留。天然软骨ECM富含GAG，主要由透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质盐和硫酸乙酰肝素组成。到目前为止，许多研究已经证实了它们在调节软骨形成方面的功能[35]，并且在生物材料中添加GAG可以促进干细胞的软骨分化。因此，较年轻的DCP中较高的sGAG含量将有利于BMSC的软骨形成。此外，由于年轻软骨组织的机械强度较低，来自年轻兔的DCPs晶粒尺寸较小，在胶原蛋白-DCP复合水凝胶中的分散均匀。据报道，当与BMSC混合时，较小的ECM颗粒可以增强细胞-材料相互作用，并提高软骨ECM衍生支架的诱导能力[36]。此外，水凝胶的力学性能也影响BMSCs的软骨形成。 由于随着兔龄的增长，DCPs的机械强度增加，胶原蛋白-DCP水凝胶的机械强度也随之增加。卞等.[37]发现，与高交联结构相比，机械强度较低的低交联密度水凝胶更有利于软骨基质的形成。然而，当利用BMSC在体外和体内进行软骨再生时，组织钙化是一个常见问题[38，39]。 在这项研究中，在胶原蛋白和胶原蛋白-3d样品中发现了这个问题，可能是由于不同的原因。胶原蛋白水凝胶在体内的组织矿化是由于其快速降解特性导致细胞结构支撑的丧失，因此无法在新组织结构形成之前维持软骨形成表型[40]。相比之下，胶原蛋白-3d的降解率远低于胶原蛋白，几乎与胶原蛋白-100d和胶原蛋白-200d相同。在这种情况下，胶原蛋白-3d诱导的组织钙化可能是由于其内在特性。由于软骨是骨骼生长的模板。胚胎阶段为骨骼发育[41]，该阶段的软骨ECM也会影响培养细胞的发育并诱导BMSC的成骨。 因此，源自新生儿ECM的胶原蛋白-3d支架继承了这一功能并导致再生基质的钙化。相比之下，胶原蛋白-100d和胶原蛋白-200d支架来源于幼年和成人ECM，不再涉及软骨内骨形成过程，也不利于BMSC的成骨分化。在这一发现的背景下，进一步比较发育生物学中不同年龄的软骨组织之间的详细组成和生物学差异将是有趣的。

结论

在这项研究中，收获了来自新生儿、幼年和成年兔的关节软骨组织并进行去细胞化。脱细胞前后3个陈年样品的机械强度、sGAG和胶原蛋白含量差异均有统计学意义。因此，由不同年龄的不同DCP制成的复合水凝胶表现出年龄依赖性软骨诱导性。一般来说，新生儿DCP促进BMSCs的软骨形成最多，但导致严重的基质钙化。相比之下，幼年和成年DCP的软骨基质产生较少，但没有观察到可见的成骨作用。总之，它强调了在软骨组织工程中使用天然软骨组织制造ECM支架时年龄差异的重要性。尽管新生儿样本具有最佳的成骨作用，但它也显示出明显的成骨作用，这将是限制其在软骨再生中应用的关键缺点。相比之下，幼年样本在促进BMSCs软骨生成和抑制成骨方面取得了总体效果。因此，青少年ECM可能是比新生儿和成人ECM更好的来源。这些发现为我们目前在设计未来基于ECM的生物材料以成功修复关节软骨方面的知识提供了重要信息。

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