94份玉米中6类真菌毒素检测及污染情况
时间：2024-05-24 阅读：430
13C-T-2 | 508.4 | 198/229/322 | 22/19/14 | 121 | 94份玉米中6类真菌毒素检测及污染情况分析 时间：2022/6/6阅读：1016 摘要：建立了玉米的一步法提取6类真菌毒素同时检测的分析方法，共分析了96份玉米中6类真菌毒素的污染情况及地域分布情况，为监测饲料质量提供技术指导。称取的样品添加6类真菌毒素同位素内标，以84%乙腈水和50%甲醇水作为提取试剂，以2mM乙酸铵0.1%甲酸水溶液和甲醇/乙腈和水为流动相梯度洗脱，采用液相色谱-串联质谱进行检测。94份玉米中6类真菌毒素的检出率为98%，单种毒素检出率最高的是伏马毒素B1和B2，高达88%，呕吐毒素和OTA检出率极低，均未检出。伏马毒素B1和B2、黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的最高残留量分别是89.1mg/kg、76.4ug/kg、3.95×103mg/kg和7.0mg/kg。地域分布上具有分布范围广，污染较严重的特点。建立的6类真菌毒素检测方法操作简单、结果准确，结果分析对玉米中真菌毒素污染检测和防控具有重要意义。 关键词：真菌毒素、液相色谱--串联质谱、污染情况、真菌毒素同位素内标 真菌毒素属于真菌的代谢产物，几乎可以污染所有的农作物，会损害动物体的肝脏、肾脏及皮肤组织等，进而通过食物链的形式影响到人体的健康。[1]已知的真菌毒素多达300种以上，目前多个国家均建立了饲料中真菌毒素的*，[2-3]我国已于2017年推出国家强制性标准GB 13078-2017饲料卫生标准，并于2018年实施，其对黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、OTA、伏马毒素B1和B2、T-2毒素等做出明确的检测方法规定和*。本文采用94份玉米为样本，对这6类真菌毒素进行检测方法开发和污染情况分析。为多毒素的快速检测提供技术支持的同时，也为饲料中真菌毒素污染的监测和防控提供帮助。本文采用液相色谱-串联质谱，通过加入同位素内标进行校正的手段，开发6类真菌毒素的检测方法，并对94份玉米样品进行6类真菌毒素的检测及污染情况分析。 1 材料 1.1仪器 TSQ Quantis液相色谱-串联质谱、KS-7200DE超声波提取仪和TGL-16M高速冷冻离心机 1.2试剂 真菌毒素标准品：黄曲霉毒素B1（货号：STD#1052）、呕吐毒素（货号：STD#3102）、玉米赤霉烯酮（货号：STD#4012）、OTA（货号：STD#5012）、伏马毒素B1和B2（货号：STD#2013）和T-2毒素（货号：STD#3111） 真菌毒素同位素内标：黄曲霉毒素B1同位素内标（货号：STD#1041U）、呕吐毒素同位素内标（货号：STD#3101U）、玉米赤霉烯酮同位素内标（货号：STD#4010U）、OTA同位素内标（货号：STD#5010U）、伏马毒素B1同位素内标（货号：STD#2030U）、伏马毒素B2同位素内标（货号：STD#2040U）和T-2毒素同位素内标（货号：STD#3110U） 1.3样品 96份玉米种类及地域分布（样品来源于全国近30个省份及地区） 96份玉米种类涉及青农1801、郑单958、万盛189、登海W189、洛玉16、中选777等。依据我国区域划分方式将94份玉米的分布区域进行汇总统计
2 方法 2.1色谱及质谱条件： 色谱柱： Hypersil GOLD C18 （100*2.1 3um） 流动相： 2mM乙酸铵0.1%甲酸水溶液和甲醇梯度洗脱伏马毒素B1和B2、黄曲霉毒素B1、OTA和T-2毒素/乙腈水梯度洗脱呕吐毒素和玉米赤霉烯酮 梯度表1
梯度表2
采用ESI离子源，分别用正离子模式扫描和负离子模式扫描，多反应监测模式（MRM）采集数据，6类真菌毒素及其对应同位素内标的质谱参数见下表： 6类真菌毒素及其对应同位素内标的质谱参数
4]+ | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DON | 295 | 138/265 | 17/12 | 109 | [M-H]- | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
13C-DON | 310 | 145/279 | 14/12 | 109 | [M-H]- | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
ZON | 317 | 131/175/273 | 30/24/19 | 170 | [M-H]- | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
13C-ZON | 335 | 140/185/290 | 31/25/19 | 178 | [M-H]- |
注：FB1为伏马毒素B1简写（下同），FB2为伏马毒素B2简写，AFB1为黄曲霉毒素B1简写，OTA为赭曲霉A简写，T-2位T-2毒素简写，DON为呕吐毒素简写，ZON为玉米赤霉烯酮简写；13C为其相应的同位素内标简写
2.2标准品的配制
2.2.1混合标准品配制：配制伏马毒素B1和B2浓度为2.4ppm、黄曲霉毒素B1浓度为80ppb、玉米赤霉烯酮1.6ppm、呕吐毒素3.2ppm、T-2毒素1.6ppm、OTA160ppb的混标
2.2.2同位素内标配制：配制伏马毒素B1和B2浓度为240ppb、黄曲霉毒素B1浓度为8ppb、玉米赤霉烯酮160ppb、呕吐毒素320ppb、T-2毒素160ppb、OTA16ppb的同位素内标混合标准品
2.3样品处理
称取5g样品各两份，加入同位素内标100uL，其中一份加入20mL84%乙腈水，另一份加入20mL50%甲醇水，超声波震荡提取20min，6000r/min离心5min，上清液过0.22um有机滤膜，液相色谱-串联质谱检测。
3.结果分析
3.1谱图
FB1、FB2、AFB1、OTA和T-2的外标及同位素内标的MRM图
DON和ZON的外标及同位素内标的MRM图
3.2回收率
项目 | FB1 | FB2 | AFB1 | ZON | DON | T-2 | OTA |
添加水平 | 600ng/g | 600ng/g | 20ng/g | 400ng/g | 800ng/g | 400ng/g | 40ng/g |
回收率 | 83.6% | 80.4% | 101.8% | 109.8% | 88.0% | 91.3% | 86.9% |
3.3线性
项目 | 相关系数 | 线性范围/ng | 线性方程 |
FB1 | 0.9991 | 0.19-100 | y = 219.68x - 1206.9 |
FB2 | 0.9996 | 0.19-100 | y = 911.45x - 1989.7 |
AFB1 | 0.9993 | 0.049-40 | y = 61482x + 6.8125 |
ZON | 0.9995 | 0.094-35 | y = 8008.3x - 42517 |
DON | 0.9999 | 2-450 | y = 2755.5x - 796.14 |
T-2 | 0.9994 | 0.1-100 | y = 110254x - 63112 |
OTA | 0.9997 | 0.01-20 | y = 1824.1x + 1.5954 |
3.4整体污染情况
对96份玉米的6类真菌毒素检测结果进行分析汇总，所有样品均未检出赭曲霉毒素和T-2毒素。96份玉米中有2份玉米不含有这6类真菌毒素，10份玉米只含有1类真菌毒素，32份玉米含有2类真菌毒素，44份玉米含有3类真菌毒素，6份玉米含有4类真菌毒素。
污染情况占比图
3.5区域分布情况
依据94份样品分布区域进行划分，对6种真菌毒素进行分析汇总（汇总表见下），西北地区玉米受真菌毒素污染的种类最少，污染程度极低；华中地区、华北地区、西南地区和东北地区毒素污染情况较重；华东地区和华南地区玉米受真菌毒素污染的种类和程度最高。
毒素种类 | 华东 | 华南 | 华中 | 华北 | 西南 | 西北 | 东北 | 总计 |
0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 0 | 2 |
1 | 2 | 0 | 0 | 1 | 1 | 5 | 1 | 10 |
2 | 6 | 2 | 6 | 7 | 4 | 1 | 6 | 32 |
3 | 13 | 5 | 6 | 9 | 5 | 2 | 4 | 44 |
4 | 1 | 3 | 0 | 0 | 2 | 0 | 0 | 6 |
5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
总计 | 22 | 10 | 12 | 17 | 12 | 10 | 11 | 94 |
3.6超限情况
3.6.1
对96份玉米的6类真菌毒素检测结果进行分析汇总，依据GB 13078-2017 饲料卫生标准*进行超限判断（表1），超限样品共计14份，其中9份样品一类真菌毒素超限，剩余5份样品两类真菌毒素超限。针对赭曲霉毒素和T-2毒素含量，所有样品均合格；此外，其余留的毒素超限情况如下：伏马毒素B1+B2、黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的超限样品份数分别为：3份、2份、11份和3份，其对应的超限率分别为3.2%、2.1%、11.7%和3.2%。
表1 部分饲料原料中6类真菌毒素检测标准及*
项目 | 产品名称 | 检测标准 | * |
黄曲霉毒素B1 | 玉米加工产品、花生饼 | NY/T 2071 | ≤50ug/kg |
OTA | 谷物及其加工产品 | GB/T 30957 | ≤100ug/kg |
玉米赤霉烯酮 | 玉米及其加工产品 | NY/T 2071 | ≤0.5mg/kg |
呕吐毒素 | 植物性饲料原料 | GB/T 30956 | ≤5mg/kg |
T-2毒素 | 植物性饲料原料 | NY/T 2071 | ≤0.5mg/kg |
伏马毒素B1+2 | 玉米及其加工产品 | NY/T 1970 | ≤60mg/kg |
3.6.2
对96份玉米的6类真菌毒素检测结果进行分析汇总，依据GB 2761-2017 食品安全国家标准 食品中真菌毒素*进行超限判断（表2），超限样品共计46份，其中25份样品一类真菌毒素超限，剩余21份样品两类真菌毒素超限。针对赭曲霉毒素含量，所有样品均合格；此外，其余留的毒素超限情况如下：黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的超限样品份数分别为：4份、35份和28份，其对应的超限率分别为4.3%、37.2%和29.8%。
表2 部分食品中6类真菌毒素检测标准及*
项目 | 食品类别 | 检验方法 | * |
黄曲霉毒素B1 | 玉米、玉米面及玉米制品 | GB 5009.22 | 20ug/kg |
OTA | 谷物及其制品 | GB 5009.96 | 5.0ug/kg |
玉米赤霉烯酮 | 玉米、玉米面（渣、片） | GB 5009.209 | 60ug/kg |
呕吐毒素 | 玉米、玉米面（渣、片） | GB 5009.111 | 1000ug/kg |
3.7 单类毒素分析
由于所有样品均未检出赭曲霉毒素和T-2毒素，故只对其余四类真菌毒素进行单独分析94份玉米中6类毒素污染情况对比图
3.7.1 伏马毒素B1+B2
对96份玉米的伏马毒素B1和B2检测结果进行分析汇总，有检出样品数量为88份，占比93.6%，检测结果在0.0503mg/kg-89.1mg/kg，中位值为6.41mg/kg；整体污染水平为10.9mg/kg，阳性污染水平为11.6mg/kg。
3.7.2 黄曲霉毒素B1
对96份玉米的黄曲霉毒素B1检测结果进行分析汇总，有检出样品数量为29份，占比30.9%，检测结果在2.20ug/kg-76.4ug/kg，中位值为4.58ug/kg；整体污染水平为3.48ug/kg，阳性污染水平为11.3ug/kg。
3.7.3 玉米赤霉烯酮
对96份玉米的玉米赤霉烯酮检测结果进行分析汇总，有检出样品数量为56份，占比59.6%，检测结果在10.6mg/kg-3.95×103mg/kg，中位值为98.3mg/kg；整体污染水平为329mg/kg，阳性污染水平为552mg/kg。
3.7.4 呕吐毒素
对96份玉米的呕吐毒素检测结果进行分析汇总，有检出样品数量为56份，占比59.6%，检测结果在0.1mg/kg-7.0mg/kg，中位值为1.0mg/kg；整体污染水平为0.8mg/kg，阳性污染水平为1.4mg/kg。
4讨论
目前，从技术角度讲，饲料中真菌毒素检测共涉及到6大类，检测标准4项，前处理方法不一，净化产品各异，对人员、操作、设备要求苛刻，给检测带来严峻的挑战；从污染根源分析，一种真菌可能产生多种毒素，一种原料会受到多种真菌感染，往往是单个饲料样品需要检测多种真菌毒素；从现实情况来看，饲料受真菌毒素污染情况较严重，且分布不均匀，需要加强其毒素监测。本文所述的一步法检测，采用直提的方式，同位素校正的手段，在保证结果准确的前提下，很大程度上降低操作难度，缩短检测周期，同时也控制了实验成本。
综上，本文不仅为饲料中6类真菌毒素的检测提供有效的方法支撑，同时也为饲料中真菌毒素残留的检测方向提供指导，为保证饲料产品的质量提供帮助。
[1]王艳霞 饲料及原料中真菌毒素的危害、降解和检测技术研究[J].饲料研究,NO.08 2022：158.
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[3]张徽,孙金旺,刘媛,等.农产品真菌毒素污染生物控制关键技术创新与 综述 NO.08 2022 160 饲料研究 FEED RESEARCH 应用[J].中国科技成果,2020(3):69-70