本人预测定大鼠脑皮层神经元的细胞内钙离子的浓度，本人的细胞是在6孔板上贴壁生长的。想请教：

1、用流式细胞测定细胞内钙离子的浓度的具体方法；
2、对细胞密度和状态有什莫要求吗？

3、整个实验过程需要自己购买什莫试剂？哪个公司可以买到？

4、Pluronic F-127起到什莫作用？恳请赐教！

我硕士的课题主要是关于钙离子的信号转导的问题 ，主要用流式细胞仪测定细胞内钙离子的变化。但流式细胞仪测定钙离子变化有一定的问题，例如在测定过程中可能会造成细胞的激活，而钙离子又是很容易激活的，会出现双峰的现象。另外测定的值是平均值。如果有条件，建议用confocal。

下面是我测定时的具体操作，希望对你有帮助。另外有一篇参考文献，如果，他也是用流式测定钙离子变化的。

用0. 1 %胰蛋白酶将已形成单层的细胞自瓶壁上消化下来,用含0. 2 %的牛血清白蛋白Hepes 液洗2～3 遍,洗净残留的胰蛋白酶溶液,离心收集细胞,200 目尼龙网过滤去除细胞团块。台盼蓝排斥实验检查,细胞成活率达85 %以上。

于细胞悬液(2 ×106/ ml) 中加入Fluo-3AM(终浓度:8μmol/L) ,置于37 ℃恒温摇床中避光孵育45 min ,使Fluo3-AM能进入细胞内并充分反应,离心沉淀细胞,以Hepes 缓冲液漂洗2～3 次,调整细胞悬液为2 ×106 个细胞/ ml ,利用流式细胞仪测得Fluo-3 与细胞内Ca2 + 结合的荧光强度F;加入钙离子载体A23187(1 ×10 - 5 mmol/ L) 及1 mmol/ L 的CaCl2 (使细胞外钙饱和) ,测得大荧光强度Fmax ;再加入荧光淬灭剂MnCl2 (2 mmol/L) ,测得小荧光强度Fmin 。

然后根据公式, [Ca2 + ]i = Kd (F -Fmin) / (Fmax - F) (nmol/ L) 计算细胞[Ca2 + ]i ,Kd = 450 nmol/ L[6 ] 。

[6 ] Gromdordy B M, Frossard N , Rhoden K J , et al . Tachykinin induced phosphoinositide breakdown in airway smooth muscle and epthelium: relationship to contraction[J ] . Mol Pharmacol , 1988 ,33 (5) :515 - 519.