B淋巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体，不同的B淋巴细胞分泌的抗体不同，每个B淋巴细胞只分泌一种抗体；但是，B淋巴细胞在体外培养条件下存活时间很短，zui多2周’然后很快死亡。用于融合的骨髓瘤细胞不分泌任何免疫球蛋白(Ig)，是一种细胞系，能在体外培养条件下持续分裂、长期存活。杂交瘤细胞便是将这两种细胞的特性结合起来，获得既能分泌单一抗体又能在体外长期培养的细胞。因此，分泌一种抗体，即单克隆抗体的杂交窄细胞便称为杂交瘤细胞株。

建立杂交瘤细胞的全程技术称为杂交瘤技术，一般需要4～6个月，包括以下阶段：融合前所需细胞的准备、细胞融合或细胞杂交、杂交瘤细胞筛选、杂交瘤细胞株的冻存。

(一)融合前所需细胞的准备

1．动物免疫准备脾细胞

动物体内的B淋巴细胞在特定外来抗原的刺激下，可以大量增殖变成浆细胞以分泌针对于该抗原的抗体。脾内不同的B淋巴细胞可分泌针对抗原的不同抗原决定簇位点的抗体。当受到特定外来抗原刺激时，相应的B淋巴细胞克隆便大量增殖以分泌相应的特异性抗体。动物免疫的作用就是用特定外来抗原对动物进行一次或多次免疫，以刺激能分泌针对于该抗原抗体的B淋巴细胞大量增殖．从而得到大量的专一B淋巴细胞。

动物免疫的方法很多，一般有常规免疫法、脾内一次性免疫法、短程免疫法和体外免疫法等。脾内一次性免疫法具有用量少、免疫程序短、不加佐剂且所得单克隆抗体的特异性较高等特点。

由于单次免疫抗原刺激后数日内就进行细胞融合，因此不存在所谓“优势克隆”的问题，从而更容易获得多种不同特异性的单克隆抗体，也能助于筛选出差别微小的两种抗原的单克隆抗体。但该方法的缺点是，其免疫效果要等杂交瘤筛选时才明了，因此在实验时有一定的随机性。此外对一些免疫原性较差的抗原，分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞筛选较困难。

常规免疫法比较可靠，在融合前能通过测定血清中的抗体滴度来证实免疫效果，因此实验成功的把握性较大。由于免疫动物多次反复接受相同抗原的刺激，会使某些特定的淋巴细胞克隆大量增殖，易形成“优势克隆”，因此产生分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞种类较少，很可能多个克隆所产生的单克隆抗体都是针对于同一个抗原决定簇的。免疫程序太长，费时费力。短程免疫法和体外免疫法均各有其优缺点。

典型的免疫程序包括初次免疫、二次免疫和加强免疫，一般需要2～3个月时间。加强免疫前，用免疫抗原构建试剂盒测定免疫动物的血清抗体滴度，符合融合需要时，在融合前3～4d进行加强免疫。前2次免疫均可腹腔注射免疫，加强免疫采用脾内注射方法。

脾内注射的方法是，无菌打开小鼠腹腔，暴露出脾脏，用1ml无菌注射器将含有适量抗原的O．1ml溶液分别注射到两只小鼠脾脏内。然后将脾脏轻轻复位，缝合伤口，正常或加强营养进行饲养备用。

2．对数生长期的骨髓瘤细胞准备

在鼠源杂交瘤技术中，常用的小鼠骨髓瘤细胞为SP2/O—Agl4，简称sP2/O。也有使用Nsl细胞的，与SP2/0一样，都是不分泌Ig的小鼠骨髓瘤细胞。

采用体外培养骨髓瘤细胞，或将骨髓瘤细胞接种到健康动物皮下生长实体瘤的方法。实体瘤生长的骨髓瘤细胞接种需要提*d进行，体外培养的骨髓瘤细胞也需提前若干天使扩大培养到107数量，要求细胞处于对数生长中晚期。所需骨髓瘤细胞可在融合前2h收集。

3．饲养细胞准备

在鼠源杂交瘤技术中，往往需要制备饲养细胞。一般取自健康小鼠腹腔，主要属于腹腔巨噬细胞。在融合前1h收集，用含血清培养液制备成2×104／m1密度的单细胞悬液。

在融合后的细胞培养过程中，起到饲养层细胞的作用。因为，融合后培养孔内的参与融合过程但未形成脾细胞一骨髓瘤细胞杂交的细胞，如脾细胞、骨髓瘤细胞、脾细胞一脾细胞杂交细胞、骨髓瘤细胞一骨髓瘤细胞杂交细胞等，都会在HAT选择培养液的培养环境中死亡．而存活的脾细胞一骨髓瘤细胞杂交细胞密度过低不利生存，需要饲养层细胞增加总体活细胞密度并吞噬死亡细胞碎片。

(二)细胞融合

细胞融合是指2个或2个以上的细胞，顺序地发生了细胞膜融合、细胞质融合和细胞棱融合等过程，然后这2个或2个以上的细胞形成1个融合细胞。即具有1套细胞膜、细胞匪和细胞核。

一般而言，遗传稳定的融合细胞仅可能来源于2个细胞之间的融合，往往保留了其中：种来源细胞的绝大多数基因组基因和另1种来源细胞的少量基因组基因，还需要及时地通过合适的分离纯化手段如克隆化培养来筛选，因此，2个细胞之间的融合并不一定能形成遗传稳定的新细胞。至于3个或3个以上的不同种类细胞，也有可能通过细胞融合形成1十I临时的融合细胞，但很难存活，不会形成遗传稳定的新细胞。综合以上因素，在融合操作中-2种细胞的比例就显得非常重要，如鼠源杂交瘤技术中，为了获得高的融合效率，免疫后的脾细胞和骨髓瘤细胞一般按6：1的数量比例混合后再进行融合操作。

细胞融合方法一般有病毒介导的细胞融合、PEG；介导细胞融合及电融合等。病毒介导的细胞融合方法要涉及仙台病毒的培养和灭活，尤其是仙台病毒的培养条件要求严格，过程比较复杂，因此现在一般不使用此方法。电融合为20世纪80年代兴起的一种融合方法，需要特定的技术条件，如需要融合仪、融合池、融合缓冲液等，通过试验探索*的细胞排队电压、脉冲方波时程大小和脉冲间隔等融合参数才能顺利进行。目前广泛使用的融合方法还是PEG融合法，该方法操作简便、快速省时．有较好的融合效果。

(三)杂交瘤细胞的筛选

脾脏是动物体内B淋巴细胞集中的zui大免疫器官，取出脾细胞(主要是B淋巴细胞)和骨髓瘤细胞融合后，能产生5种混合细胞类型：未融合的脾细胞和骨髓瘤细胞，自身融合的脾细胞和骨髓瘤细胞，以及脾细胞和骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。

在细胞融合后，要从上述5种细胞中筛选出杂交瘤细胞，一般使用HAT选择培养基进行筛选。

HAT培养基中含有次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)和胸腺嘧啶(T)三种成分。细胞的DNA合成有内源性途径(主要途径)和外源性途径(旁路途径)两种方式。内源性途径利用谷氨酰胺或单磷酸尿苷酸在二氢叶酸还原酶催化下合成DNA，外源性途径则是利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(TK)的催化下补救合成DNA，HAT培养基中氨基蝶呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂，能有效地阻断DNA合成的内源性途径。B淋巴细胞具有HGPRT、TK这两种酶，因此在内源性途径被阻断后仍能利用HAT培养基中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶来合成DNA，可在HAT培养基中存活．

但B淋巴细胞是正常细胞，故不能长期存活。鼠源杂交瘤技术中使用的SP2／0细胞为HGPRT的TK缺陷型，缺乏HGPRT酶和TK酶，在内源性途径被阻断后不能进行D_＼A的外源性合成，故不能在HAT培养基中存活。杂交瘤细胞由于继承了B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，能够合成HGPRT酶和TK酶，故在HAT选择培养基中能存活.

因此，将融合后的混合细胞在HAT选择培养基中培养1～2周后，只有杂交瘤细胞能存活下来。

(四)分泌抗体的杂交瘤细胞检测

存活下来的杂交瘤细胞不一定分泌抗体，因此，选择并构建合适的检测方法用于及时、快速、准确地检测细胞克隆生长孔内的杂交瘤细胞是杂交瘤技术的关键技术之一。所构建的抗体检测方法还能满足在短时间内检测大量样品的需求。

常用的方法有ELISA(酶联免疫吸附法)、间接免疫荧光法和双相扩散法等，其中，ELISAzui常见。
一般是在单细胞克隆长满100×显微视场时进行分泌抗体检测。有抗体分泌的孔称阳性孔，单细胞克隆孔或单克隆孔的细胞克隆称为阳性克隆，所分泌的抗体即称为单克隆抗体。

(五)分泌抗体的杂交瘤细胞克隆化培养

对阳性孔中的杂交瘤细胞进行克隆化培养的方法包括有限稀释法、软琼脂平板法和显微操作法等．以前者zui常见。

为了建立能稳定分泌异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，往往需要进行多次克隆化培养，直至所有单克隆孔的抗体表达量稳定、一致时．便建立了一种杂交瘤细胞株。

(六)细胞株冻存及其他

遗传稳定的分泌异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，可进行扩大培养．然后命名、冻存。

杂交瘤细胞株的建立，是为了获得持续分泌单克隆抗体的细胞株，以便制备各种用途的单克隆抗体。因此，需要对所分泌抗体进行免疫反应性分析和Ig类型分析，为以后应用该抗体提供必要的技术参数。单克隆抗体的免疫反应性是指该抗体与其他抗体在与抗原反应时是否存在交叉反应，提示与其他抗体识别的抗原位点是否一致或相近。单克隆抗体的lg类型分析是检测所分泌抗体的重链类型．如IgG、IgM或其他类型。