一般在细胞接种或传代后，每天或至多间隔1～2d观察细胞的形态、生长、培养液pH和污染与否等，随时掌握细胞的动态变化，以便作换液或传代处理。如发现异常情况，即刻采取措施。

一、细胞培养常规检查

(一)一般形态观察

生长状态良好的细胞在普通显微镜下观察时可见，细胞透明度大，轮廓不清，只有用相差显微镜观察，才能看清细胞的细微结构。细胞内颗粒少、无空泡，胞膜清晰，培养上清液清澈透明，看不到悬浮细胞和碎片；细胞功能不良时，轮廓增强，胞质中常出现空泡、脂滴和其他颗粒状物，细胞之间空隙加大，细胞形态可变得不规则，甚至失去原有特点。只有生长状态良好的细胞才能用于实验。

细胞生长过程中，CO₂积累增多，由于培养液内含有pH指示剂，因此其颜色变化可间接反映细胞的生长状态。正常情况下，培养液呈桃红色；呈橙黄色时，细胞一般生长状态较好；呈淡黄色，则可能是培养时间过长、营养不足、细胞死亡过多；呈紫红色，则可能是细胞生长状态不好，或已死亡。

（二）细胞增殖生长状态

初代或传代培养时，都有一长短不同的潜伏期。传代细胞系、胚胎组织或幼体组织潜伏期短，一般在第二天即可见细胞生长，一周内便可连接成片。成体组织的潜伏期长，老龄组织和癌组织更长，有时可达一周左右。

初代组织块培养法细胞生长，zui先从组织“长”出的为游走细胞，它们多单独活动，形态不规则，用缩时逐格显微摄电影法可显示出极活跃的变形、游走和吞噬活动。在游走细胞之后，接着长出的是成纤维细胞或上皮细胞。只有当出现细胞分裂、细胞数量逐渐增多、形成较大生长晕或连接成片时，细胞才真正进入增殖状态。成纤维细胞是zui易生长细胞，生长速度较快，低倍镜下观察时，前哨部位细胞似火焰状或放射形状向外扩展；如接种为游走细胞、胶质细胞等细胞，在密度不大时，可连接成网状，只有细胞密度增大时才连接成片。

上皮细胞排列紧密，相互接壤成膜状；上皮膜边缘整齐，细胞很少单独活动，生长时整个上皮膜发生移动。上皮细胞尤其是外胚层来源的细胞如表皮细胞等，生长过程中常产生溶解酶，能使细胞间质发生液化，导致细胞相互分离，严重时可导致细胞脱落，其确切机制尚不明了．可能与产生透明质酸酶有关。

细胞接种后，经过悬浮期、潜伏期和指数增生期等后，zui终将长满瓶壁，如不及时做再培养，由于营养物质消耗和代谢产物积累，细胞即进入停滞期。此时细胞轮廓增强，细胞内常出现前述有膨胀线粒体形成的堆积物，细胞变得粗糙，严重时细胞从瓶壁脱落，只有及时做传代，才能使细胞继续生长。

(三)培养液

在正常情况下，培养液pH介于7．2～7．4，呈红色。用一般培养箱培养时，随细胞生长时间延长，CO₂积累增多，在超过缓冲范围之后，营养液酸化逐渐变黄色，这时如不
及时调节pH，会对细胞产生不利影响，严重时可使细胞退变死亡。培养液中加N-(2-羟乙基)N’-2-乙烷磺酸（N-2 Hydroxyethylpiperazme-N’-2-ethanesulionicacid，HEPES)或用5％CO₂温箱培养可使pH维持稳定。用含磷酸盐缓冲系统培养液时，可因瓶口漏气，CO2溢出，也可能由于培养瓶塞洗刷不洁，残留碱性物质所致，使之变为碱性而呈红色。更换营养液的时间，可依据营养物质的消耗而定，细胞生长旺盛时，2～3d更换一次；生长缓慢时，3～4d更换为宜。需特别注意，各种细胞对pH的要求不同。

(四)微生物污染

在长时间反复培养过程中，即使细胞培养用品消毒操作严密，也会偶尔发生细菌、支原体、真菌、病毒和其他杂质细胞污染，需随时注意，一旦发生污染，应及时进行处理。

二、活细胞直接观察方法

(一)相差观察和摄影

1．相差装置的使用 相差装置或显微镜都是由两部分组成，相差聚光器和相差接物镜。在每个相差接物镜的光学系统中都有一个光环透镜；在聚光器内有数个可转换的相位板，一定倍数的接物镜使用时需与相应的相位板一致。相差观察时对照明要求严格，光轴要对正，视野照明光度需均匀。

2．操作步骤

(1)调好相位板，使聚光器相位板号与接物镜放大倍数(相位板)相一致。

(2)抽取接目镜，再更换辅助望远镜，移动辅助镜筒并调整聚光器相位板，使视野中两个大小一样的光环必须相互吻合。

(3)再重新换上原接目镜，即成相差图像；当更换不同倍数接物镜时，需按上述过程重新调节。

3．注意事项

(1)对培养瓶、皿要求：相差显微镜观察要求底物平坦、质地均匀、透光度强；一般玻璃器皿凹凸不平，不适合做相差观察和摄影，用质地均匀的塑料器皿培养较好。

(2)准备：观察和摄影前，要擦净培养瓶表面，切勿残留污迹而影响透光度。

(3)调光：调整照明光的照明度及光轴，使视野照明均匀。对准光轴是显微摄影的重要条件，否则不易获得理想效果。

(4)在无自控摄像装置初次拍摄时，应将放大倍数、照明强度和曝光等条件逐一记录，再做一组不同曝光时间的试验，显影后选取*组合，作为以后再拍摄时的标准。

(二)细胞

培养细胞生长在瓶底上，zui适用倒置光相差显微镜观察，而且需附有长焦距集光器，才能观察厚度较大的培养平皿。培养瓶壁厚度一般均大于20um，只限于用40×接物镜，若用油浸镜观察细胞更细微结构，需用支持物培养法，将细胞培养在长方形盖玻片上，观察时应从瓶中取出，制成临时标本。

1．取一大型载物片，另取小块滤纸剪成长方形，置于载玻片上。

2．用吸管向滤纸框中滴加数滴培养液，使之充满框内空间和浸湿滤纸框。

3．把生长有细胞的盖玻片放在纸框中(使细胞面向上)，再覆以大盖玻片。

(三)注意事项

1．观察时液体不断蒸发，随时应从标本侧方滴加营养液，但不宜过多，以防液体浸过上方大盖玻片，影响油浸观察和摄影。

2．本法只限短时间观察细胞之用。在使用加温载物台对维持细胞功能更好，但能观察2h左右。观察时间过长，随培养液蒸发、pH改变，细胞形态和机能状态都将发生改变。

三、缩时显微摄像术和闭路电视记录

缩时显微摄电影术(time-lapse cinemicrophotography，TLCM)是直接记录活细胞动态变化zui为理想的方法，本法能记录细胞连续动态变化过程。因细胞动态变化过程缓慢，为能达到肉眼可见的程度，需用TLCM法或定格拍摄法。用TLCM法拍摄细胞时需用具有TLCM装置的显微镜，如Nikon和Olympus均有该产品，可用于拍摄记录细胞动态变化，如细胞运动、细胞分裂、细胞膜变化、细胞死亡等过程。TLCM法的不足之处在于拍摄后底片加工繁琐。用TLCM法进行拍摄或闭路电视记录培养细胞超过48h时，培养液中应加HEPES或安装自动换液系统，以维持培养液较恒定的pH、更新营养成分、去除代谢产物，使细胞能良好生长。