外泌体（Exosome）发现于1986 年，是一种直径约30~100nm 的双层膜囊泡状结构小体，可由机体内多种细胞如免疫细胞、干细胞、心血管细胞、 网织红细胞、 血小板、 神经细胞和肿瘤细胞等主动分泌产生， 广泛分布于外周血、尿液、唾液、 乳汁、腹水、羊水等体液中。

外泌体携带大量特异性的蛋白质（如细胞因子、生长因子）以及功能性的mRNAs、miRNAs等生物活性物质，在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肿瘤免疫等生理过程，与多种疾病的发生和进程密切相关。由于外泌体的特殊结构和功能， 使得它具有潜在的应用价值，一方面可以作为诊断多种疾病的生物指标，另一方面也可以作为治疗手段，未来有可能作为药物的天然载体用于临床治疗。

01

外泌体研究，应选用血浆还是血清？

答：

血清是血液凝固之后收集的液体，所以其中少了纤维蛋白原，凝血因子，以及多了很多凝血产物。纤维蛋白原可转化为纤维蛋白，具有凝血功能。在凝血过程中血小板会分泌大量的外泌体，有研究发现血清中有接近50%的外泌体来自额外的分泌。

血浆=血液-血细胞

血清=血浆-纤维蛋白原-凝血因子

所以一般实验选择血浆，在特殊情况下，如研究与血小板相关的疾病的时候，当然是血清更适合。

02

外泌体的分离方法这么多，选择哪种更好？

答：

外泌体的分离纯化一直是科研工作者关注的问题，获得高纯度的外泌体对后续的研究至关重要。据了解，目前人们多采用超速离心、免疫磁珠、 超滤、 沉淀或试剂盒等方法实现外泌体的提取分离：
1、 超速离心法（差速离心）

超离法是常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行（ 如图所示） ，可分离到大小相近的囊泡颗粒。超离法因操作简单，获得的囊泡数量较多而广受欢迎，但过程比较费时，且回收率不稳定（可能与转子类型有关），纯度也受到质疑；此外，重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量。

2、密度梯度离心

在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，是一种区带分离法。通过密度梯度离心，样品中的外泌体将在 1.13-1.19g/ml
的密度范围富集。此法获得的外泌体纯度较高，但步骤繁琐，耗时。

3、超滤离心

由于外泌体是一个大小约几十纳米的囊状小体，大于一般蛋白质，利用不同截留相对分子质量(MWCO)的超滤膜对样品进行选择性分离，便可获得外泌体。超滤离心法简单高效，且不影响外泌体的生物活性，是提取细胞外泌体的一种新方法。

4、磁珠免疫法

外泌体表面有其特异性标记物（如 CD63、 CD9 蛋白），用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。磁珠法具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点，但是效率低，外泌体生物活性易受 pH 和盐浓度影响，不利于下游实验，难以广泛普及。

5、PEG-base 沉淀法

聚乙二醇（ PEG）可与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀，早先应用于从血清等样本中收集病毒，现在也被用来沉淀外泌体，其原理可能与竞争性结合游离水分子有关。利用PEG沉淀外泌体存在不少问题：比如纯度和回收率低，杂蛋白较多（ 假阳性），颗粒大小不均一，产生难以去除的聚合物，机械力或者吐温-20 等化学添加物将会破坏外泌体等，因此发表文章时易受质疑。

6、 试剂盒提取

近几年来，市场上已出现各种商业化的外泌体提取试剂盒，有的是通过特殊设计的过滤器过滤掉杂质成分，有的则采用空间排阻色谱法(SEC)进行分离纯化，也有的则利用化合物沉淀将法外泌体沉淀出来。

03

外泌体提取试剂提取外泌体检测需要多少血浆呢？

答：

1-2mL的血浆足够后续的QPCR检测；4mL的血清或血浆可满足RNA测序和蛋白质谱的需求。

04

如何鉴定提取出来的外泌体？

答：

根据国际细胞外囊泡协会于2014年发表的一个指导手册（MISEV），鉴定外泌体首先需要通过WB来鉴定细胞外囊泡的标志蛋白是否存在于样品中，通过电子显微镜来观察样品中细胞外囊泡的形态特征，通过NTA等手段来分析样品中细胞外囊泡的群体特征（粒子浓度、直径分布等）。

05

提取出来的外泌体能否应用于细胞共培养？

答：

我们提取出来的外泌体通过粒径检测能判断其纯度（粒径大小均在外泌体的大小范围），电镜检测能判断其形态确为外泌体。

如果样品中的外泌体有活性的话是可以进行细胞共培养的实验的。

06

外泌体如何保存？

答：

纯化完成后的外泌体可分装成50-100uL后置于-80℃保存。

07

外泌体提取试剂盒从2mL血清血浆提取出来的外泌体能有多少？

答：

2mL血清血浆提取出来的外泌体数量约1*10的8次方-9次方，可以满足后续的电镜和WB。

08

BCA方法测定的蛋白浓度是多少？

答：

BCA方法测定的蛋白浓度为2~4ug/uL。

09

外泌体电镜是不是一定要有膜结构，无膜结构的球体对不对？

答：

负染电镜结果中外泌体的形态肯定是那种明显的茶托样或者大饼样的！边缘有一圈略微更明亮的亮圈。如果你打到的结构是没有膜结构的圆球形，那么您很可能看到了脂蛋白颗粒或者抱团的蛋白质。

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为什么超速离心提取外泌体看不到沉淀？

答：

这种问题通常有三种可能性：

1）使用的细胞上清或者血清量太低，从而造成了这样的结果。

2）使用了不透明的超速离心管，一般来说外泌体产量都比较小，所以凡是不透明的管子，基本都是很难见到明显沉淀的，可以当做有沉淀，然后操作下去即可。

3）使用了角转。部分品牌离心机的角转管壁粘附性很低，超离结束没多久沉淀就会滑落下去，所以请在离心结束时赶紧去收样。