目前用于分离BMSCs的方法主要有五种，分别是贴壁筛选法、骨组织消化法、密度梯度离心法、免疫磁珠分选法和流式细胞仪分离法。

上篇我们介绍了贴壁筛选法、骨组织消化法的原理和特点，这篇就和大家介绍其他三种分离方法：密度梯度离心法、免疫磁珠分选法和流式细胞仪分离法，一起为您的实验挑选合适的分离方法吧！

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密度梯度离心法

密度梯度离心法是针对骨髓中不同细胞的大小和密度差异进行分选，骨髓细胞悬液加入到密度梯度离心液上面，通过离心使得不同类型细胞沉降至其等密度点，然后吸取特定位置富集的细胞。

常见的梯度离心液有Ficoll、Ficoll-Paque、percoll、Lymphopre等，具有低粘性和低渗透性的特性，使用密度约为1.077g/mL。在离心分层时，红细胞及多核细胞因比重(1.080g/mL) 较大而沉降于底部，其次是单个核细胞（包括BMSCs、造血干细胞、单核细胞等） ，悬浮密度位于(1.056~1.075) g/mL，血浆及其溶解物悬浮密度位于1.050g/mL。位于分离液之上的灰白色云雾状层即为单个核细胞层，在获取该层细胞后再通过差速贴壁法去除未贴壁细胞（如图1）。

图1. 密度梯度离心法分离BMSCs

使用密度梯度离心法分离BMSCs效果好，但操作严格，不易掌握。

02

免疫磁珠分选法

免疫磁珠分选法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合的原理。在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。

免疫磁珠分选法分为正选法和负选法。在正选法中，磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞；而在负选法中，磁珠结合不需要的细胞，游离于上清液的细胞即为所需目的细胞。

图2. 免疫磁珠分选法分离BMSCs

由于目前BMSCs表面缺乏特异性抗原，暂时无法进行正选，故需采用CD11b负选法。CD11b被认为是粒细胞的特异性标记，其实CD11b在巨噬细胞等表面也有大量分布，而且表达的量和粒细胞差不多。鉴于骨髓基质细胞中有核杂细胞，主要为中性粒细胞，单核细胞和巨噬细胞，因此可以采取CD11b负选法来去除这些杂细胞，从而获得目的细胞BMSCs。

免疫磁珠分选法也是一种简单高效的分离方法，仅需磁性分离器，不需要专业设备辅助，分离获得BMSCs细胞通量高。

03

流式细胞仪分离法

流式细胞仪分离法原理是：当经荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中，被高压压入流动室内。流动室内充满鞘液，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴充以正、负不同的电荷，当液滴流经过带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。

图3. 流式细胞仪分离法原理(Hai-jian Sun, Jian Chen, Bing Ni.et al.2015)

这种方法需要流式仪器辅助操作，调节仪器参数，技术难度较高。且对细胞刺激大，易污染。

总结

五种培养方法各有利弊，小伙伴们可根据自己的实验目的、实验室条件及实验周期选择一个最合适的方法。