原代细胞培养的应用

1、为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段;

2、为传代培养创造条件;

3、服务于临床实践，用于药物筛选等。

原代细胞培养之取材

取材作为原代细胞培养过程中的第一部至关重要，以下几种取材技术，你都用过哪些方法呢？

各类组织取材，操作及注意事项：

1.皮肤和粘膜

主要取皮片，面积一般2~4平方厘米。

2.内脏和实体瘤

1）无菌环境；

2）熟悉所需组织的类型和部位；

3）要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织。

3.血液细胞

一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中(如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等)分离细胞，取材时应注意抗凝。

4.骨髓、羊水、胸/腹水细胞

严格无菌，注意抗凝，还要尽快分离培养，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。

5.动物组织取材——鼠胚组织

1）用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物；

2）将其浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟后取出动物；

3）在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤；

4）用无菌操作法解剖取胚。

6.动物组织取材——幼鼠胚肾(或肺)

幼鼠采用上述方法处死消毒后→腹部朝上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉开至两侧→采用无菌法打开胸腔取肺，或从背部打开腹腔取肾。

7.鸡(鸭)鸟类胚胎组织

1）取孵化至适当胚龄(9~12天)的胚蛋，用照蛋灯在暗处灯检，若有丰富血管、胚体有运动的胚蛋，说明胚体发育良好，并用有色笔划出气室和胚体位置；

2）将胚蛋置于蛋架上，先用温水清洗蛋壳，再用75%酒精棉球擦干;

经碘酒、75%酒精消毒后，在无菌条件下采用无菌法用剪刀或镊子打开气室，沿气室边缘去除蛋壳;

3）用眼科镊撕去壳膜，暴露出鸡胚;

4）用弯头镊轻挑起胚头，取出胚胎，放入无菌平皿中，解剖取材。

原代细胞培养之分离注意事项

1.组织块培养法

1）组织块接种后的前3天，在观察和移动的过程中，注意不要引起液体的振荡。要避免经常翻动和振动，否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。

2）加入的培养液不宜过多，避免浸泡的组织块受轻微的波动而脱落下来。

3）当细胞向外迁徙出来后要注意记录并去除漂浮的组织块和残留的细胞，它们产生的有毒物质会影响原代细胞的生长。

4）为促进组织块尽快粘贴在培养瓶皿上，可以在种植前先将胶原薄层涂在培养瓶底壁上。

2.贴壁型原代细胞

1)原代培养的分离细胞在初次接触体外环境时，它们之间会互相影响，在这些细胞之间能产生一些促生长的活性物质，使细胞彼此互相促进存活和生长。如果接种的细胞密度过低，细胞之间的促生长作用很小，也很难使细胞适应从体内的组织环境到被分散后进入独立生存环境的变化过程。如果接种的细胞密度过大，会导致营养物质供应不足，代谢废物积累较快需要经常换液和传代。

2）适当增大原代培养接种的细胞密度，给培养的细胞提供更多的类似于在体内时细胞之间的相互作用，会极大提高原代培养的细胞在体外存活率。待细胞适应体外环境后进行传代培养时再以较低的密度接种和培养。

3）尽快使接种的细胞贴壁，是决定培养能否成功的关键。可以在接种后先将培养瓶置培养箱内培养3h到5h，待细胞贴壁后，再补足培养液继续培养。

3.悬浮型原代细胞

1）必须保持细胞的悬浮状态。可以通过增加培养液的黏度来帮助细胞呈悬浮状态，如给培养液中加入低浓度的透明质酸复合物。在有搅拌装置的培养器皿内加入培养液是，以5ml为限度，否则搅拌时会产生气泡对细胞造成伤害。使用这种方式需注意勿使搅拌速度过快，否则即可使培养液溢出又容易造成污染。如果培养液的量在5ml以下，可以采用旋转瓶培养。给悬浮培养的细胞换液时要注意不要吸出细胞。

2）能够进行悬浮培养的细胞，其生命力一般都比较旺盛，体外分裂增殖的速度较快，营养成分消耗大，换液时间隔一般较短。