菌落总数测定操作步骤及注意事项

一、测定标准

参考食品国家标准：GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》。

二、操作过程

1、前期准备：

根据国家标准，提前准备好要用的平板计数琼脂、平皿、试管、稀释液（生理盐水）、三角烧瓶等，相应的材料进行灭菌处理（干热灭菌或高压灭菌）。

2、接收样品：

收到样品后，确认样品包装是否完好，登记样品信息，并将其保存在2~8℃冰箱中，然后在取样时取出。

3、样品处理：

按照作业指导书操作，仔细阅读实验要求。一般实验室收到的是干粉样品、固体样品、或者液体样品等。假如收到干粉样品，那么首先需要将其配置成水溶液（即水化）。根据实验要求及经验，进行预判，预估稀释液倍数，溶解即可。

4、实验前准备：

4.1实验操作最好在超净台或者生物安全柜里操作，需要把超净台或者生物安全柜提前清理、消毒处理，确保实验环境无菌。

4.2提前把要用到的平皿、试管、稀释液等放到操作台上紫外杀菌。

5、实验操作：

5.1稀释

将样品从冰箱中取出达到室温后开始取样，在超洁净台或者生物安全柜下先用少许稀释液（选取的生理盐水）进行水化后吸入无菌瓶或袋中，再用剩余的稀释液进行洗涤并全部转入无菌瓶或袋中。

洗涤转移时注意样品瓶盖的清洗和无菌操作，将全部的水化液进行均质混匀，一般作为原液立刻进行接种；再取25ml到225ml稀释液中均质混匀，制成10-1梯度样品匀液。

用1ml无菌吸管取1:10的样液到9ml生理盐水试管中，制成1:100的样液，以此类推。再将几个稀释度的样液接种到提前做好标记的无菌平皿中。

5.2倾注平板

将提前在水浴锅里凉至46℃的平板计数营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。倾注过程一般左手拿平皿，右手拿琼脂瓶，左手将平皿打开30°左右的缝隙，倾注琼脂大约到平皿底的二分之一处，左三圈、右三圈轻轻混匀，然后放到台面上。待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h。

5.3观察计数

24h观察检测结果有无异常现象，是否有蔓延菌落出现。48h再按照GB 4789.2的要求进行菌落计数。在对结果进行分析后，选取检测结果的平均值为最终数据。

三、注意事项

1、当无法预判样品菌落总数含量时，需要梯度稀释，此步骤尤其关键，必须尽可能地减少误差。

2、倾注用培养基应在46℃水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易凝固，不能与菌液充分混匀。如无水浴条件，应以皮肤感受较热而不烫为宜。

3、倾注培养基的量规定不一，从12~20ml不等，一般以15ml较为适宜，平板过厚会影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。

4、倾注过程力度一定掌握好，绝不能把琼脂溅出来。

5、为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿时要尽可能放在中央部位，然后应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不易过长，以防止细菌有所死亡或繁殖。

6、琼脂培养基放水浴锅前一定要混合均匀，以防出现平皿不凝固现象；拿出倾注时要用喷有75%酒精的抹布擦拭干净。

7、冷却的过程不要着急，冷却充分后再倒置放进培养箱培养，放置的时候要尽量避免放到风机口处，每摞不要超过6个平皿。

8、检测结束后所有的稀释液样品可放到冰箱里0-5℃冷藏，以备实验出错时再用。

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