奶牛的乳腺分支形态发育是完成泌乳功能的基本条件。乳腺分支结构可以通过提高乳腺腺泡组织的数量和分泌功能来提高奶牛乳产量。3D培养可以在体外诱导组织器官分支形态的发生，已经是研究乳腺分支形态普遍使用的方法。

类器官(Organoids)是器官特异性细胞类型的3D细胞集合，这些细胞从干细胞或器官祖细胞发育而来，并能以与体内相似的方式经细胞分序(cell sorting out) 和空间限制性的系别分化而实现自我组建。

图1 奶牛乳腺类器官明场图展示

一、产品信息

二、组分信息

三、培养方法

1、原代培养

1）取材后的奶牛乳腺组织须在 2-8℃含有组织保存液 E的取样瓶中，快速转运至洁净实验室进行组织处理和干细胞分离，拍照并登记信息。
2）准备若干培养皿，加入 4℃预冷的奶牛乳腺类器官培养缓冲液 B备用。
3）取样瓶消毒，将组织放入培养皿中，利用奶牛乳腺类器官培养缓冲液 B清洗三次后，利用眼科剪或手术刀将肿瘤组织剪切成体积约为1-3mm3的组织块。
4）组织用奶牛乳腺原代组织消化液 C消化，37℃震荡消化10-20min，（消化过程中随时观察消化情况）。
5）取少量液体在显微镜下观察，镜下观察到较多的单个细胞或 70um 以下的细胞簇后，加入三倍体积奶牛乳腺类器官培养缓冲液 B终止消化。
6）使用100um孔径的筛网进行过滤，将滤液收集后，于300g富集离心5min后移去上清，添加奶牛乳腺类器官培养缓冲液 B重新重悬离心。
7）基质胶计算：第6步后观察收集到的组织体积，添加25倍组织体积的基质胶重悬铺板。
8）24孔细胞培养板为例，每孔点胶25ul组织基质胶混合物进行铺板（4℃下操作）。
9）将铺好的培养板放入37℃培养箱中10-15min成胶，添加奶牛乳腺类器官培养基 A（恢复室温）进行培养。

2、 类器官传代培养

1）移液器吸去培养基，每孔添加1-2ml 4℃类器官缓冲液 B放置2min；
2）移液抢轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中，4℃静置10min（每6-8孔为一组）；
3）a. 类器官数量不足或体积较小时： 离心5min弃去上清，添加适量奶牛乳腺类器官缓冲液 B重悬移入1.5ml离心管，300g离心5min弃去液体进行第4步；
b. 类器官数量较多或体积较大时：离心5min弃去上清，添加适量类器官传代消化液 D消化2-3min，添加奶牛乳腺类器官缓冲液 B终止消化，离心5min弃去混合液，添加适量奶牛乳腺类器官缓冲液 B重悬移入1.5ml离心管，300g离心5min弃去液体进行第4步；
4）类器官收集后，添加基质胶重悬，每孔25ul基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中10-15min添加500ul奶牛乳腺类器官培养基A。

3、类器官冻存

1）移液器吸去培养基，每孔添加1-2ml 4℃类器官缓冲液 B放置2min；
2）移液抢轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中，4℃静置10min（每6-8孔为一组）；
3）离心5min弃去上清，添加适量奶牛乳腺类器官缓冲液 B再次重悬，300g离心5min弃去液体；
4）添加适量类器官冻存液 F，轻柔吹打重悬，以24孔细胞培养板为例：密度为2个孔冻存1管，每管体积1.4ml；
5）做好标记信息，进行程序降温后，移入液氮长期保存。

4、 类器官复苏

1）取10ml奶牛乳腺类器官培养缓冲液 B于15ml离心管中；
2）从液氮罐中取出冻存的类器官细胞，快速置于 37℃水浴锅中融解；
3）水浴融解过程中，需轻轻摇动冷冻管，以确保冻存液在 1-2min内充分融解；
4）将溶解后的类器官细胞快速转移至15ml 离心管，使用移液管轻轻吹打6-8次，300g 离心 5min，然后除去上清液并收集类器官细胞沉淀。添加适量奶牛乳腺类器官缓冲液 B重悬移入1.5ml离心管300g离心5min；
5）基质胶重悬，每孔25ul基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中10-15min成胶，添加500ul奶牛乳腺类器官培养基 A。

图2 奶牛类器官试剂盒组分展示

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