实验小白来集合！染色质免疫共沉淀(ChIP)实验流程与常见问题
时间：2023-09-14 阅读：800
染色质免疫共沉淀技术的原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
一、细胞交联与裂解
在装有20ml生长培养基的150mm培养皿中培养贴壁细胞，长到80%-90%密度，约107个细胞。如有必要，可进行刺激或处理。建议采用1×106个细胞作为一次ChIP的细胞量。
1）在20ml培养基中加入终浓度为1%的甲醛，轻轻涡旋培养皿混匀，使细胞在甲醛中固定，室温固定10分钟（对于转录因子和转录辅因子，可适当延长交联时间，但不超过30分钟）。加入甲醛后培养基的颜色会发生改变；
2）在培养皿中加入浓度为0.125M的甘氨酸，轻轻涡旋混匀，室温反应5分钟，淬灭未反应的甲醛，终止交联。加入甘氨酸后培养基的颜色会发生改变；
3）弃培养基，20ml预冷的1×PBS洗涤细胞，重复洗涤一次；
4）在培养皿中加入2ml 预冷的含蛋白酶抑制剂混合物的1×PBS；使用细胞刮收集细胞，4°C，800g，离心5分钟；
5）去除上清液（此步细胞可在液氮中快速冷却，存放于-80°C保存几个月），细胞再次重悬于0.5ml含蛋白酶抑制剂混合物的细胞裂解缓冲液中，冰上孵育15分钟，每5分钟涡旋一次；
6）4°C，800g，离心5分钟。小心去除上清液，加入0.5ml含蛋白酶抑制剂混合物的细胞核裂解缓冲液，使其重悬。
二、超声处理片段化 DNA
超声处理的效果取决于细胞类型、细胞浓度和仪器。需要通过预实验确定超声的最佳条件，以便将交联DNA剪切为如上图的约200-1000bp长度。染色质片段化对于ChIP实验成功很关键。片段化不足会导致样本丢失，片段化过度会破坏靶标蛋白表位、降低ChIP效率。在超声过程中，保持样品一直处于冰上低温状态。不要使探头接触超声管底部或管壁，如超声过程产生泡沫，需暂停超声并调整超声管位置。
超声处理后，4°C，12000g离心10分钟。离心后，留取5μl染色质溶液进行琼脂糖凝胶分析，以检测超声效率。可将超声前和超声后各取的5μl染色质溶液对比分析。
图1 超声前超声后
三、靶蛋白和DNA 免疫共沉淀
将下述缓冲液放于冰上保存：低盐洗涤缓冲液高盐洗涤缓冲液，LiCl洗涤缓冲液和TE洗涤缓冲液。配制450μl稀释缓冲液（含蛋白酶抑制剂混合物），冰上保存。如有多个样品可合并配制。
1）取上述50μl离心后的裂解液上清加入到新的离心管中，作为一次免疫沉淀实验的DNA混合物样本。每50μl 裂解液中含有1×106个细胞裂解产物。ChIP反应包括阳性对照抗体管、阴性对照IgG管和目的蛋白抗体管。推荐阴性对照IgG和目的抗体使用同一物种来源。
2）在上述50μl片段化染色质样品的离心管中加入上述配制好的450μl稀释缓冲液，充分混匀。每管取5μl样品于新的离心管中作为实验的1% “input”，用于实验的优化与数据处理，保存于4°C，直至蛋白DNA复合物洗脱与解交联步骤。
3）取完inpμt的离心管中分别加入1-10μg免疫沉淀抗体，4°C转子上孵育4h以上或过夜。
4）每个离心管中加入20μl蛋白A/G磁珠（建议将吸头前端剪去一小部分后再吸取磁珠），4°C转子上孵育2h。
5）磁力架吸附，静置1-2分钟，去上清。按如下步骤洗涤蛋白A/G磁珠-抗体-蛋白/DNA复合物：
低盐洗涤缓冲液，4°C转子上孵育3-5分钟，洗涤一次；
高盐洗涤缓冲液，4°C转子上孵育3-5分钟，洗涤一次；
LiCl 洗涤缓冲液，4°C转子上孵育3-5分钟，洗涤一次；
注：使用前将等体积A液及B液混匀，请勿提前混匀，否则会导致出现沉淀析出。TE 缓冲液，4°C转子上孵育3-5分钟，洗涤一次。
图2 靶蛋白和DNA免疫共沉淀示意图
四、洗脱和解交联
实验前准备：解冻蛋白酶K；ChIP洗脱缓冲液恢复至室温，以确保SDS溶解；配制洗脱缓冲液；ChIP洗脱缓冲液100μl+蛋白酶K 1μl（多个样本可合并配制）。
1）样品管及Input管加入ChIP洗脱缓冲液（含蛋白酶K）；
2）62°C孵育2小时；
3）在95°C下培养10分钟；
4）让样品冷却至室温；
5）10000g离心10秒收集管盖及管壁上残留样品，采用磁力架分离磁珠。将上清液小心转移至一个新的试管中。
五、DNA 纯化
采用纯化柱进行DNA纯化（免疫沉淀和input）。
六、鉴定分析
QPCR或者高通量测序的方法检测IP得到的DNA。
七、常见问题
常见问题 | 常见原因/解决办法 |
阴性对照（IgG IP）样品的背景高 | 1、优化抗体的浓度，过量抗体导致非靶点的结合； 2、与微珠的非特异结合：采用预纯化步骤，以排除这些非靶点，或加入微珠的封闭剂； 4、试剂被污染； 5、增加洗涤次数。 |
DNA 回收率低 | 1、ChIP 抗体失效或亲和力低，使用 ChIP验证过的抗体； 2、抗体使用量不足； 3、起始样品不足，可适当增加起始样品用量； 4、过度交联或交联不足； |
无法找到合适的ChIP抗体，该如何做ChIP实验？ | 1、使用标签抗体是一种解决抗体无法获得、抗体可变性和交联染色质的表位被遮蔽的方法。不过标签有可能干扰转录因子的功能； 2、尝试IP/IHC/IF抗体，效果需要自己摸索鉴定。 |
阴性对照抗体如何选择？ | 使用与ChIP抗体相同物种的正常IgG，因此如果使用小鼠单克隆抗体，建议使用正常小鼠IgG。 |
货号 | 品名 | 规格 |
abs50034 | 染色质免疫共沉淀（ChIP）试剂盒 | 22T |
abs47050830 | 甘氨酸 | 1kg |
abs961 | 10×PBS缓冲液 | 500ml |
abs9118 | 蛋白酶K | 100mg |
abs9330 | 核糖核酸酶 A | 150ul |
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