“你好，我的样本是养的细胞，我还能做多色组化吗？”

答案是可以！对于多重荧光免疫组化（mIHC）来说，几乎不挑剔样本类型，但需要攻克一个难题——多轮洗脱。传统的组织样本经过前期处理固定包埋，再加上防脱载玻片的助力，在洗脱过程中，脱片概率相对小，即使有小部分脱落，但影响不至于很大；而细胞样本，有可能在一张片子上，本身细胞数量就不多，如果还有脱落，可能最后“颗粒无收”。今天Absin分享的是细胞样本做多色的方法，其中不能缺少的依旧是我们的“老演员”——抗体洗脱液（abs994）。

一、建议操作步骤：

1）样本准备：制备细胞样本（细胞爬片、细胞涂片等），建议直接使用腔室载玻片进行细胞培养，方便后续检测。完成制备后，用PBS简单漂洗（2×2min）；
2）细胞固定：用4%多聚甲醛常温固定10-20min，PBS洗涤3×5min；
3）淬灭内源性过氧化物酶：滴加3% H₂O₂，室温下孵育10-30min，PBS洗涤3×5min；
4）细胞通透（胞膜指标省略此步）：滴加含1-0.25% Triton X-100的PBS溶液，室温下处理10min，PBS洗涤3×5min；
5）封闭：滴加封闭液（5%二抗同来源封闭血清或BSA），室温孵育30min；
6）一抗孵育：弃封闭液，滴加稀释好的一抗工作液，于避光湿盒内4°C孵育过夜或37℃ 1-2h（湿盒中可加少量水，防止抗体孵育过程干片），PBS漂洗3×5min；
7）二抗孵育：滴加与一抗相应种属的HRP二抗覆盖组织，避光室温孵育20-50min，PBS漂洗3×5min；
8）染料孵育：滴加现配的1*TSA染料工作液（使用信号放大液按1:100稀释），反应1-10min，PBS漂洗3×5min；
9）抗体洗脱：抗体洗脱液37℃预热，甩去PBS后，滴加洗脱液浸润整个爬片，洗脱时间可控制在15-30min（洗脱难度：结构性膜蛋白和细胞骨架蛋白＞胞浆蛋白＞胞核蛋白），PBS漂洗3×5min；
10）重复进行步骤[5→9]，直到完成所有指标染色；
11）滴加1*DAPI工作液到样品上，浸没样本区域，室温孵育10min，PBS漂洗3×5min；
12）滴加抗荧光淬灭封片剂，用盖玻片封片，避免气泡；
13）扫描成像，数据分析。

二、注意事项：

1）若某些抗体难以洗脱，建议降低一抗稀释比例，或将该靶点排到最后一轮进行染色；
2）抗体洗脱液在使用时要根据实际情况调整孵育时间和洗脱温度，若时间太长有可能损伤抗原靶点以及细胞核形态；
3）若既有膜指标又有胞内指标，可先做膜指标，再做胞内指标，在进行胞内指标染色之前再进行打孔，若一开始就打孔，可能影响胞膜指标的染色；
4）由于细胞样本可能存在的脱片问题，可在开始多色实验之前先模拟多次抗体洗脱的过程，多次使用抗体洗脱液洗脱与PBS漂洗，观察细胞脱落情况，若明场不便观察，可染一下DAPI再观察；
5）上述操作步骤并不一定适合所有样本和抗体，需要根据实际情况调整实验细节。

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Absin特色产品线：

WB相关：ECL发光液、预染marker、预制胶；IHC相关：二抗试剂盒、组化笔；IP/CoIP试剂盒；激动剂/抑制剂；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡试剂盒；呼吸爆发试剂盒；ELISA试剂盒；重组蛋白；抗体: 二抗、标签抗体、对照抗体；定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)...