产品专题——聚凝胺(Polybrene)，基因转染增强剂
时间：2023-09-28 阅读：596
产品介绍
聚凝胺（Polybrene），也称海美溴铵 （Hexadimethrine Bromide），是一种多聚阳离子聚合物。聚凝胺目前广泛用于逆转录病毒及慢病毒介导的基因转染，作用机理可能是通过中和细胞表面唾液酸与病毒颗粒之间的静电排斥从而促进吸附作用。聚凝胺也常用于哺乳动物细胞的DNA转染实验以增强脂质体的转染效率。其也是一种有名的抗肝素剂（肝素拮抗剂），用来生产非特异性凝集的红细胞。另外，由于少量的聚凝胺在自动测序分析中可以增加多肽的降解现象，因此聚凝胺也多用于蛋白测序。
使用方法
本品为无菌溶液，浓度为10mg/mL使用时一般按1:1000-1:2000稀释，依细胞种类不同稀释比例不同，具体查阅相关文献或根据实验室经验来调整。
实验1：病毒感染
1）重组逆转录病毒原液的制备：取5mL生长培养基加入约含单层转染逆转录包装细胞的100mm培养盘内。孵育24h后，吸去培养液并用0.45μm滤器过滤；
2）待感染细胞的培养：100mm培养盘内加入10mL培养基，细胞密度约为5×105/盘；
3）病毒感染：细胞培养24h后，吸去培养液。用含聚凝胺的2mL病毒上清（或将病毒原液稀释到2mL）感染细胞，聚凝胺的终浓度为5μg-10μg/mL。37°C孵育3-6h；
4）收集病毒颗粒：加入8mL培养基。感染3天后，按照1:5的比例用选择培养基裂解细胞。
实验2：DNA转染
1）生长培养基培养细胞，培养细胞密度约50%；
2）孵育细胞18-24h后准备DNA-培养基-聚凝胺混合液，按如下操作制备混合液：
✦ 添加培养基（60mm培养皿2mL，100mm培养皿3mL）37°C预热；
✦ 添加10ng~10µg质粒轻轻混匀；
✦ 加入聚凝胺至终浓度为5μg-10μg/mL。轻轻混匀。以上每个成分需要按顺序加入。
3）去除培养基，在细胞中加入DNA-培养基-聚凝胺溶液，在37°C孵育细胞6-20h。细胞培养的前6h内约每1.5h轻柔混匀；
4）去除DNA-培养基-Polybrene溶液。用DMSO shocksolution（15%DMSOin1×HBSS）轻轻盖住细胞（60mm培养皿3mL，100mm培养皿4mL）。每次加入溶液时用手轻轻摇晃培养盘10s，使得液体均匀分布。然后37℃孵育细胞4min；
5）立即去除DMSO shocksolution，用生长培养基轻轻清洗细胞2次。对于60mm培养皿每次用5mL培养液清洗，100mm培养皿每次用10mL培养液清洗；
6）加入培养基到细胞中；
7）稳定转化：去除生长培养基，按照1:5的比例用选择培养基裂解细胞。瞬时表达：去除生长培养基，加入新鲜的生长培养基。24-72h后收获细胞。
应用案例
例1：聚凝胺用于慢病毒介导的基因转染
在筛选稳定表达ORF3a的多克隆THP-1细胞株实验中，研究人员在收集慢病毒上清液后，加入8μg/mL Polybrene感染THp-1细胞。
参考文献：SARS-CoV-2 ORF3a positively regulates NF-κB activity by enhancing IKKβ-NEMO interaction.Virus Research,2023.
例2：聚凝胺用于假病毒中和试验
在银杏酸抑制SARS-CoV-2及其变异体的机制研究中，将受试化合物与hACE2/HEK293T细胞在37℃预孵育1h，然后在每孔中加入SARS-CoV-2假病毒和6μg/mL Polybrene孵育24 h，感染后48h计算IC50。
参考文献：Ginkgolic acids inhibit SARS-CoV-2 and its variants by blocking the spike protein/ACE2 interplay. International Journal of Biological Macromolecules,2023.
例3：聚凝胺用于筛选-D-表型红细胞
在初筛选实验中，聚凝胺按4/3梯度连续稀释制备梯度液，以聚凝胺梯度液：IgG抗-D比例 3：2配制混合液，在96孔板中，每孔加入30μL上述混合液后，每列再依次加0~35μL LIM液（以 5μL为梯度递增），最后加入 30μL 3%红细胞悬液，混匀，500×g离心5min，750 rpm震荡3min，观察不同表型细胞结果。
参考文献：赵俸涌,王中英,张玉宇等.应用聚凝胺筛选-D-表型红细胞的研究[J].中国输血杂志, 2021.
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