大家好！今天我们来聊聊免疫组化(IHC)实验的操作流程。IHC是一个超级强大的技术，能够让你在组织切片中找到特定的蛋白质。跟我来，我们一步步搞定它，让实验变得轻松愉快！

IHC实验流程：通常包括样本固定、包埋、切片、脱蜡水化、抗原修复、灭活、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色、复染、封片观察12个部分。

1、样本固定

目的：确保组织样本的质量和完整性，为后续的免疫染色打下坚实基础。

操作步骤：

1）取材：从动物或人体取得所需的组织样本。对于组织块，要确保其大小适中，不宜过大，以便于固定液能够充分渗透；

2）初步处理：如果组织样本带有血液或其他体液，应先用生理盐水或PBS进行冲洗，以去除这些可能影响固定效果的物质；

3）固定：将组织样本放入固定液中。常用的固定液有4%多聚甲醛溶液(abs9179)，冰冻切片/神经组织可以使用OCT包埋剂(abs9756)固定液的量通常为组织体积的10-20倍，以确保组织能够充分浸入固定液中。大组织标本应切开固定，以免中间部分自溶解腐败。

 注：固定时间根据组织类型和实验要求而定，一般固定时间室温18-24h。

4）固定后的处理：固定完成后，将组织从固定液中取出，用流水冲洗数分钟，以去除残留的固定液和可能产生的结晶。

注意事项：

固定的时间不宜过长，以免导致组织过度硬化和抗原性的丧失；

固定的温度通常为室温或 4°C，避免高温导致组织损伤；

在固定过程中，要确保组织样本wan全浸入固定液中，避免出现未固定的部分；

固定的容器应干净、无杂质，避免对组织造成污染。

2、包埋

目的：保护和支撑组织样本，以便在切片时保持其完整性。通过将组织样本嵌入到固体介质中，可以制作出适合在显微镜下观察的薄切片。

根据样本类型可以分为石蜡切片免疫组化(IHC-P)和冰冻切片免疫组化(IHC-F)，石蜡切片免疫组化虽然操作更加复杂，但其可以更好的保持组织的形态结构，厚度更薄便于染色和观察，以及可以常温保存多年的优点，在实验中更为常用。

基本步骤：

1）脱水：在组织样本固定后，需要将其中的水分去除，以便于包埋介质能够充分渗透。酒精梯度脱水：75%乙醇(1h)——85%乙醇(1h)——95%乙醇(1h)——100%乙醇(50min)——100%乙醇(50min)——100%乙醇(50min)

2）透明：脱水后，组织样本会变得不透明，需要使用透明剂（如二甲苯）来去除其中的酒精和其他溶剂，使组织样本变得透明。通常用二甲苯浸泡：二甲苯(40min)——二甲苯(40min)——二甲苯(40min)

3）浸蜡：将透明后的组织样本放入熔化的石蜡中，让石蜡充分渗透到组织样本中。这个过程通常需要在温箱中进行，以确保石蜡的均匀渗透：63℃石蜡(50min)——63℃石蜡(50min)——63℃石蜡(50min)

4）包埋：将浸蜡后的组织样本放入模具中，倒入熔化的石蜡，然后让石蜡冷却凝固。这样，组织样本就被包埋在石蜡中了。

注意事项：

在包埋过程中，要控制好温度和时间，以确保石蜡的均匀渗透和组织的完整性。

包埋后的组织块需要冷却凝固后才能进行切片。在冷却过程中，要避免过度冷却导致石蜡碎裂或组织变形。

在包埋前，要对组织样本进行充分的固定和脱水处理，以确保其抗原性和完整性。

3、切片

目的：将包埋后的组织样本切割成薄片，以便于在显微镜下观察和检测。

基本步骤：

1）切片前的准备：确保包埋后的组织块已经充分冷却并固化。使用适当的切片机进行切片；

2）切片：将包埋好的组织块固定在切片机的样本夹上。调整切片机的切片厚度，通常为4-5微米厚，这个厚度是根据需要检测的抗原和实验要求来确定的；

3）展片：使用刷子或毛笔轻轻地将切好的组织切片从刀上取下，并放在温水(40℃)中展开；

4）烤片：60℃烤片2h。

注意事项：

在切片过程中，要控制好切片机的速度和切片刀的锋利度，以获得高质量的切片。

切片后，要及时对切片进行处理，以避免抗原的损失和组织的变性。

使用适当的黏贴剂，确保切片牢固地附贴在载玻片上，以便于后续的免疫组化实验。

4、脱蜡水化

目的：将组织切片从石蜡中释放出来，并使其恢复到适合进行后续抗原检测和染色的状态。

基本步骤：

1）脱蜡：切片首先被置于二甲苯中浸泡，以溶解和去除切片上的石蜡。将切片放置于切片架内：二甲苯(5min)——二甲苯(5min)——二甲苯(5min)

2）水化：100%乙醇(5min)——100%乙醇(5min)——95%乙醇(3min)——85%乙醇(3min)——75%乙醇(3min)——去离子水(5min)

注意事项：

彻di脱蜡：脱蜡过程必须彻di，以确保石蜡被wan全去除。否则，残留的石蜡会影响后续的抗原检测和染色。

避免干燥：在整个脱蜡水化过程中，应确保切片始终保持在湿润的状态，避免干燥。干燥会导致非特异性抗体结合，从而出现高背景染色。

5、抗原修复

目的：通过修复过程暴露被固定时隐藏的抗原表位，提高抗体的结合效率。zui常用的修复缓冲液是10mM的pH6.0柠檬酸钠(abs9248)、pH9.0的Tris-EDTA(abs9342)、pH8.0的EDTA。建议测试多种方法以寻找染色效果好的方法。

抗原修复的方法：

1）微波热修复：加入抗原修复液，放入切片，置于微波炉中火8min，停火7min，转小火8min；取出染色盒，冷却至室温；

2）水浴热修复：加入抗原修复液，放入切片，置于水溶锅中加热，其间不断用温度计测其温度，待抗原修复液的温度达到有效度(92℃)，维持40min后取出染色盒，冷却至室温；

3）高压热修复：在染色盒中加入抗原修复液，放入切片，置于高压锅内加热至饱压后继续加热5min，关闭电源，10min后取出染色盒，冷却至室温；

4）酶解修复：常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等。将切片置于含有酶解液的载玻片上，然后在适当的温度和湿度条件下进行酶解（通常为37°C，20min）。酶解后，同样需要冷却切片至室温再进行后续处理。

注意事项：

加热后需自然降温；

使用过量的抗原修复液；

修复液的不同pH值对染色结果的影响比较大；

没有一种抗原修复缓冲液可以适用于所有抗原。不同的抗体可能需要不同的抗原修复方法和条件，因此需要根据实验要求和抗体特性选择合适的抗原修复方法。

6、灭活

目的：消除细胞或组织中内源性酶和活性物质的影响，降低背景噪音，提高实验的特异性和敏感性。

1）灭活内源性过氧化物酶：HRP检测系统，常用的去除内源性过氧化物酶的方法是3%过氧化氢水溶液，室温10min；

2）洗涤：用PBS或TBS等缓冲液洗涤切片、浸泡2次，5min/次。

 注意事项：

H₂O₂需现用现配，且4℃避光保存，否则易引起非特异背景；

H₂O₂孵育时间过长也会易引起脱片；

部分组织还含有内源性碱性磷酸酶，可用左旋咪唑进行灭活。

7、封闭

目的：封闭组织切片上非特异性结合位点，防止抗体与这些位点结合，从而减少背景信号。

基本步骤：

1）非特异位点封闭：将封闭液 （如abs933山羊血清）滴加到组织切片上，确保封闭液均匀覆盖整个组织区域。然后将切片放入湿盒中，在室温或37°C下孵育30min，让封闭液与组织切片充分作用。

2）洗涤：封闭结束后，用PBS或TBS等缓冲液洗涤切片，以去除未结合的封闭液和可能存在的杂质。

8、一抗孵育

免疫组化中的一抗孵育是免疫组化实验的关键步骤之一。

目的：特异性识别目标抗原，为后续的检测提供准确标记。

基本步骤：

1）选择一抗：根据实验目的选择特异性高、亲和力强的一抗。一抗应该与目标抗原的种属来源、类型等相匹配；

2）稀释一抗：根据一抗的效价和实验要求，用适当的稀释液如PBS、TBS等（或abs9299抗体稀释液）稀释一抗；

3）涂覆一抗：将稀释好的一抗均匀涂覆在已封闭的组织切片上，确保抗体能够充分接触组织切片上的抗原；

4）孵育：将稀释好的一抗均匀滴加在已封闭的组织切片上，放入湿盒中，室温 (或37°C) 孵育1h，使一抗与抗原充分结合。

注意事项：

确保一抗的质量和特异性，避免使用过期或质量不佳的一抗；

充分洗涤组织切片，去除未结合的一抗和其他杂质，减少背景染色。

9、二抗孵育

目的：二抗的作用是与一抗结合，形成抗原-抗体-抗体复合物，从而增强信号的强度和特异性。

在免疫组化实验中，二抗通常带有标记酶 (如HRP.AP等)，这些标记物在后续的显色步骤中可以产生可见的染色信号，便于在显微镜下观察目标抗原在组织中的分布和表达情况。

二抗孵育的基本步骤：

1) 稀释二抗：参考二抗的说明书，按照适当比例用封闭液或其他适当的溶液稀释二抗；

2) 孵育二抗：将稀释好的二抗滴加在已经过一抗孵育并洗涤的组织切片上，室温孵育30min-60min。

3) 洗涤：孵育完成后，使用洗涤液（如PBST或TBST）在摇床上缓慢摇动洗涤切片，以去除未结合的二抗和其他杂质。洗涤通常需要重复几次，每次洗涤时间一般为5-10min。

10、显色反应

目的：显色检测中需要考虑的其他因素有酶和显色底物的选择。每种检测酶都有几种不同的显色剂，HRP-DAB是zui常用的显色剂组合。

原理：在免疫组化中通常使用辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)等作为标记酶。这些酶能催化底物发生颜色反应，从而在抗原所在的位置形成可见的沉淀物。

基本步骤：

1）加入酶的底物（如HRP的底物为DAB，AP的底物为BCIP/NBT）。

2）底物在酶的作用下发生化学反应，形成有色沉淀物，通常呈现棕色（对于HRP-DAB系统）或蓝色（对于AP-BCIP/NBT系统）。

3）密切观察切片显色程度和显色时间，一般为3-8min，及时用蒸馏水洗脱，防止显色过深。通过显微镜观察组织切片上的颜色变化，可以确定抗原在细胞或组织中的位置和表达水平。

注意事项：

DAB工作液现用现配

选择适当的检测系统：根据实验目的和样本特性选择合适的检测系统；

优化条件：对一抗、二抗的浓度、孵育时间和温度等条件进行优化，以获得最佳的检测结果；

注意防护：DAB为联苯偶氨化合物，可诱发皮肤癌和膀胱症，在显色操作过程中需注意防护。

11、复染

目的：为了形成细胞轮廓，更好的定位目标蛋白，可进行复染。

复染：滴加80-100μL苏木素染色液至wan全覆盖组织，室温孵育5min，1%盐酸酒精分化1s，自来水稍洗，自来水返蓝5min。

注意事项：

复染的时间是需要摸索的，这个与苏木精的配制时间有关；

如果染色过浅可重复染色，如果染色过深可使用盐酸进行分化。

12、封片观察

目的：在免疫组化实验中，封片观察是最后的步骤，用于保护组织切片、增强对比度和稳定性，并允许在显微镜下进行长期观察和分析。

封片步骤：

1）脱水：在完成所有染色步骤后，通常需要将组织切片进行脱水处理，以去除切片上的水分。切片依次使用70%、85%、95%乙醇、无水乙醇I、无水乙醇Ⅱ分别浸泡1min。

2）透明：脱水后，切片需要进行透明处理，以便封片剂能够均匀分布在切片上。通常使用二甲苯浸泡两次，每次1min。

3）封片：将一滴封片剂（如中性树胶abs9177）滴在组织切片上，然后用盖玻片轻轻覆盖。封片剂的选择取决于实验要求和标本类型。封片时要确保没有气泡产生，并且盖玻片与切片之间紧密贴合。

4）干燥：让封片剂自然干燥，或者可以在温箱中加速干燥过程。干燥后的切片可以长期保存，并随时用于观察。

希望这份IHC实验操作流程指南能帮助您在实验中取得令人满意的结果！如果有任何问题或需要进一步的帮助，请随时联系爱必信生物，我们随时为您提供支持。

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