细胞活性检测 | 揭秘细胞活力的六大常用方法
时间：2024-09-11 阅读：370
在生物医学研究的广阔领域中，细胞活性检测扮演着至关重要的角色。它不仅帮助科学家们评估细胞的生存状态，还能深入了解细胞对药物、环境变化或病理过程的响应。细胞活性检测通常包括测量细胞增殖、细胞毒性和细胞死亡等方面。今天，小爱向大家介绍细胞活性检测的六大常用方法：ATP生物发光法、LDH检测法、MTT比色法、CCK-8法、荧光染料法和细胞凋亡检测法，一起揭秘细胞活力的科学奥秘。
1、ATP生物发光法
细胞内ATP（腺苷三磷酸）的含量是细胞能量代谢的直接指标。ATP生物发光法通过测量细胞内ATP的水平来评估细胞活性。这种方法具有高灵敏度和宽动态范围，尤其适合于需要高灵敏度检测的实验。
图1 ATP检测试剂盒(abs580117)检测细胞活性的原理图
ATP生物发光法的主要原理是在有氧环境下，荧光素在荧光素酶和Mg2+的催化作用下与ATP发生反应，生成荧光素-AMP复合体并释放出焦磷酸(PPi)。随后，荧光素-AMP复合体在O2的作用下进一步生成氧化荧光素，同时释放出CO2和H2O。在这个过程中，激发态的氧化荧光素返回到基态时会发出光子，光子的数量与ATP含量成正比，因此可以通过测量光强度来定量ATP的含量。
2、LDH检测法
乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase, LDH)是一种广泛存在于细胞中的酶，它在糖酵解途径中起着关键作用，能够催化乳酸和丙酮酸之间的可逆反应。LDH催化乳酸产生丙酮酸，丙酮酸与 2,4-二硝基ben肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈棕红色，颜色的深浅与丙酮酸的浓度呈正比，通过测定OD值，可计算LDH的活力。在细胞活性检测中，LDH的释放通常被用作细胞膜完整性的指标。当细胞膜受损时，细胞内的LDH会释放到培养基中，通过测定培养基中LDH的活性，可以评估细胞的损伤或死亡程度。
3、MTT比色法
MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物）比色法是一种经典的细胞活性检测方法。它通过测量活细胞中脱氢酶的活性，将MTT还原成紫色的甲瓒产物，从而间接反映细胞的代谢活性。这种方法操作简单，成本低廉，是实验室中常用的筛选工具。
4、CCK-8法
CCK-8(Cell Counting Kit-8)法是一种基于WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-2H-四唑单钠盐）的比色方法。它通过测量细胞线粒体脱氢酶的活性来评估细胞活性。CCK-8法具有较高的灵敏度和较宽的动态范围，适合于各种细胞类型的活性检测。
5、荧光染料法
荧光染料法利用特定的荧光染料，如Calcein-AM或CFSE，来标记活细胞。这些染料在活细胞内被代谢成荧光产物，通过流式细胞仪或荧光显微镜进行检测。荧光染料法可以提供直观的细胞活力图像，适用于细胞增殖和迁移研究。
6、细胞凋亡检测
细胞凋亡是细胞程序性死亡的过程，与细胞活性密切相关。通过Annexin V和PI（碘化丙啶）染色，可以检测细胞表面的磷脂酰丝氨酸外化，从而评估细胞凋亡的程度。这种方法对于研究细胞死亡机制和药物毒性具有重要意义。
细胞活性检测六大常用方法优缺点比较
检测方法 | 优点 | 缺点 |
ATP生物发光法 | 灵敏度高，能快速检测细胞活性，操作简便，直接反映细胞的代谢活性，与细胞数量成正比。 | 可能受到样品中其他ATP来源的干扰，如微生物污染。 |
LDH检测法 | 比色法操作简便快速，标准曲线法精确定量，灵敏度高，适用于多种细胞类型，反映细胞膜完整性，也可以用来评估细胞毒性。 | 可能受到样品中其他LDH来源的干扰，如微生物污染。只能反映细胞死亡，不能直接反映细胞增殖。 |
MTT比色法 | 成本较低，操作简单，适用于多种细胞类型。能够反映细胞的代谢活性，尤其是线粒体的活性。 | 需要活细胞参与，死亡细胞无法进行检测。 需要较长的孵育时间，实验周期较长。 |
CCK-8法 | 操作简便，灵敏度高。适用于各种细胞类型，包括悬浮细胞。能够反映细胞增殖和活力。 | 相对于MTT，CCK-8的成本可能较高。对某些细胞类型可能存在毒性。 |
荧光染料法 | 可以实时监测细胞活性，适合长时间跟踪实验。如Calcein-AM可以被活细胞中的酯酶切割产生荧光，从而指示细胞活性。 | 荧光染料可能对细胞有一定的毒性，尤其是在高浓度或长时间染色时。此外，荧光信号可能会受到光漂白的影响。 |
细胞凋亡检测法 | 可以特异性地检测细胞凋亡，如通过Annexin V和PI染色，可以区分早期和晚期凋亡细胞。 | 需要特定的试剂和设备，如流式细胞仪，操作相对复杂，成本较高。 |
每种方法都有其特定的应用场景和限制，选择合适的检测方法需要根据实验的具体需求和条件来决定。
下面小爱着重为大家介绍具有高灵敏度、操作简便、快速等优点的ATP检测法。
ATP检测试剂盒(abs580117)使用方法
一、产品组成
组分 | 规格 |
ATP Assay Buffer | 50mL |
D-luciferin | 120μL |
Cofactor | 120μL |
Luciferase | 120μL |
ATP Standard (100μM) | 200μL |
说明书 | 1份 |
二、使用方法
1、需自备的试剂和器材
1）细胞培养用pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)
2）Triton X-100
3）系列可调节量程移液器及吸头
4）离心管及白色96孔板
5）化学发光酶标仪
2、实验前准备
1）样品准备：
①细胞培养上清的准备：将需要测定的细胞接种到培养板中，经过干预因素处理后，直接吸取细胞上清，如果是悬浮细胞，4℃、300g离心5min，收集上清。
②细胞裂解上清的准备：将需要测定的细胞(1×106-1×107)收集到5mL的离心管中，4℃、300g离心5min，弃去上清，然后加入200μL含0.1%Triton X-100的PBS，冰浴裂解30min，4℃、10000g离心10min，收集上清。
③组织裂解上清的准备：将需要测定的组织(20-50mg)收集到玻璃匀浆器或自动匀浆管中，然后加入500μL含1%Triton X-100的PBS，匀浆1min，4℃、10000g离心10min，收集上清。
注：各种样品，如果不立即进行测定，请冻存于-80℃；正式测定前根据预实验结果，利用ATP Assay Buffer将样品适当稀释后进行测定。
2）标准品的准备：
在1.5mL离心管中，加入990μL ATP Assay Buffer，再取10μL的100μM浓度ATP Standard加入离心管中配制1μM浓度ATP Standard；然后取另外8根1.5mL离心管，分别加入200μL ATP Assay Buffer，再吸取200μL的1μM浓度ATP Standard依次倍比稀释为0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312、0.0156、0.0078、0.0039μM浓度。
3）检测工作液的准备：
ATP检测工作液的配制：根据待测样品数参考下表配制适当量的ATP检测工作液，表中试剂按比例混合后即为ATP检测工作液。
样品组分 | 1个样品 | 10个样品 | 100个样品 |
ATP Assay Buffer | 47μL | 470μL | 4.7mL |
D-luciferin | 1μL | 10μL | 100μL |
Cofactor | 1μL | 10μL | 100μL |
Luciferase | 1μL | 10μL | 100μL |
3、操作步骤
1）在白色96孔板中设置空白对照孔、标准品孔和样品孔，参考下表，在空白对照孔中加入50μL ATP Assay Buffer，在标准品孔中加入50μL梯度浓度ATP 检测工作液(0.0039-1μM)，在样品孔中加入50 μL样品。
| 空白对照孔 | 标准品孔 | 样品孔 |
ATP Assay Buffer | 50μL | —— | —— |
ATP Standard | —— | 50μL | —— |
样品 | —— | —— | 50μL |
ATP检测工作液 | 50μL | 50μL | 50μL |
2）如上表所示，各孔加入50μL的ATP检测工作液，混匀，室温孵育5min。
3）待反应完成后，利用化学发光酶标仪测定相对发光强度(RLU)。
4）计算结果：利用标准品浓度为横坐标，RLU值为纵坐标制作标准曲线，并获得横纵坐标之间的函数关系式，然后利用各样品的RLU值计算样品中ATP浓度。ATP标曲测定如下图所示：
细胞活性检测是连接基础研究与临床应用的桥梁。通过上述六种常用方法，研究人员可以更准确地评估细胞的生存状态，为疾病治疗和药物开发提供重要信息。随着生物技术的不断进步，未来可能会有更多创新的检测方法问世，为我们揭示细胞活力的更多奥秘。
本期产品推荐：
货号 | 产品名称 | 规格 |
abs580117 | ATP检测试剂盒 | 96T |
abs580007 | 乳酸脱氢酶检测试剂盒 | 96T |
abs50010 | MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒 | 500T |
abs50003 | CCK-8试剂盒 | 500T |
abs42014734 | 钙黄绿素-AM | 1mg |
abs9106 | CFSE | 50mg |
abs50001 | Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒 | 100T |
细胞染色产品推荐：
货号 | 产品名称 | λEx/λEm (nm) | 产品描述 |
abs45153674 | DiO 高氯酸盐(绿色) | 484/501 | 活细胞示踪、细胞膜染色 |
abs47048165 | DiD 对氯苯磺酸盐(红色) | 644/663 | 活细胞示踪、细胞膜染色 |
abs80001 | 霍乱毒素B亚单位(CTB) | — | 神经示踪剂 |
abs80003 | 霍乱毒素B亚单位-FITC | 494/520 | 神经示踪剂 |
abs45153692 | DiR 碘化物(深红色) | 748/780 | 动物活体成像 |
abs42075819 | D-荧光素钾盐 | — | 动物活体成像 |
abs47048270 | 罗丹明标记鬼笔环肽(橙红) | 540/565 | 细胞骨架染色（F-action） |
abs47048271 | 鬼笔环肽-Fluor 488(绿色) | 493/517 | 细胞骨架染色（F-action） |
abs47048272 | 鬼笔环肽-Fluor 555(橙红) | 556/574 | 细胞骨架染色（F-action） |
abs47014944 | 钙黄绿素红(红色) | 560/574 | 细胞质染色 |
abs9106 | CFSE(绿色) | 492/517 | 细胞质染色 |
abs42006041 | DASPEI | 550/573 | 线粒体染色 |
abs9103 | JC-1 | 585/590 | 线粒体膜电位检测 |
abs47038870 | 溶酶体绿色荧光探针 | 504/511 | 溶酶体染色 |
abs47038871 | 溶酶体红色荧光探针 | 577/590 | 溶酶体染色 |
abs9819 | PKH26红色荧光细胞连接试剂盒 | 551/567 | 外泌体染色 |
abs9820 | PKH67绿色荧光细胞连接试剂盒 | 490/502 | 外泌体染色 |
abs47038874 | 内质网绿色荧光探针 | 489/520 | 内质网染色 |
abs47038875 | 内质网红色荧光探针 | 587/615 | 内质网染色 |
abs47047616 | DAPI染色液(蓝色) | 364/454 | 细胞核染色 |
abs813337 | Hoechst 33342(蓝色) | 350/461 | 细胞核染色 |
abs9104 | 7-AAD(红色) | 545/650 | 细胞核染色 |
abs9358 | PI染色液(红色) | 535/617 | 细胞核染色 |
abs45153639 | Fluo 3-AM | 506/526 | 钙离子（Ca2+）探针 |
abs42197174 | DCFH-DA | 502/523 | 活性氧（ROS）探针 |
abs42016243 | DAF-2 DA | 491/513 | 一氧化氮（NO）探针 |
abs47044989 | WSP-1 | 465/515 | 硫化氢（H2S）探针 |
Absin产品线：
爆款产品：试剂盒(mIHC、IHC、凋亡、ELISA、ChIP、Co-IP、TR-FRET、生化检测、残留检测、多因子检测)；细胞培养(类器官试剂盒+基质胶，胎牛血清+培养添加剂+细胞因子)、分化试剂盒；分子(mRNA合成服务+提取试剂盒)；化合物大包装；辅助试剂、耗材/仪器、定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)...
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