小伙伴们在上篇学习了ELISA实验的原理、类型，并且根据自己的需求选择了适合自己的试剂盒，那接下来就是ELISA的实操了，包括哪些实验步骤和注意事项呢？快来和小爱一探究竟吧！

ELISA实验步骤

图1 ELISA标准实验流程

1、样本采集：

a）血浆：采集血浆时可使用EDTA、肝素或柠檬酸盐作为抗凝血剂。采集后30min内，1000xg离心15min。立即检测或分装后于≤-20℃储存。避免反复冻融。

b）细胞培养上清液：通过离心去除颗粒，立即检测或分装后将样品于≤-20°C储存。避免反复冻融。

c）细胞裂解液：在裂解缓冲液中裂解细胞并将其放在冰上静置30min。14,000xg离心5min除去不溶物。将上清液转移至新管中利用总蛋白分析法定量总蛋白浓度。立即检测或分装后将样品于≤-20°C储存。

d）乏血小板血浆：在采集血浆时可使用EDTA、肝素或柠檬酸盐作为抗凝血剂。采集后30min内，1000xg离心15min。建议在2-8°C下，10,000xg再次离心10min，以便去除血小板。立即检测或分装后于≤-20°C储存。避免反复冻融。

e）血清：使用不含抗凝剂的收集管，让样品在室温下凝结30min，然后1000xg离心15min。立即取出血清并进行检测或分装后于≤-20°C储存。避免反复冻融。

f）唾液：将唾液收集到管中，10,00xg离心5min。收集水相，立即检测或分装后将样品于≤-20°C储存。避免反复冻融。

g）尿液：无菌进行当天shou次尿液的采集(中段尿)，直接排入无菌容器中。离心去除不溶颗粒物质。立即检测或分装后于≤-20°C储存。避免反复冻融。

h）母乳：2-8°C，1000xg离心15min。重复进行水相部分的收集，总共3次。立即检测。

i）组织匀浆液：制备方法因组织类型而异。用1XPBS缓冲液冲洗以除去多余血液，使用20mL 1XPBS进行匀浆，并于≤-20°C下储存过夜。将匀浆液冻融两次以便破坏细胞膜，然后5000xg离心5min。去除上清液后立即进行检测，或者分装后于≤-20°C储存。避免反复冻融。

j）组织裂解液：用PBS冲洗组织，将组织切成1-2mm的薄片，用组织匀浆器在PBS中进行匀浆。加入等体积的含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液，在室温下裂解组织30min，裂解过程中轻摇裂解液。离心去除沉淀。利用总蛋白质分析法定量总蛋白的浓度。立即检测或分装后于≤-20°C储存。

2、预实验

ELISA实验中进行预实验是非常有必要的，一方面为了检测试剂盒是否好用，标曲拟合线性是否良好，最高OD值是否能达到2.0左右，是否存在假阳性假阴性；另外一方面为了检测样本最佳稀释比例，样本浓度过高要进行稀释；样本浓度过低要选择超敏试剂盒。

3、ELISA实验对照

1）空白对照：提供背景信号参考，并确保读取值表示样品中的分析物浓度。

2）阳性对照：已知含有目标蛋白的内源性可溶样品，或已知含有检测抗体免疫原的纯化蛋白或多肽来作为阳性对照。当样品的检测结果为阴性时，阳性对照的阳性结果可表明实验过程无误且有效，所以实验的阴性结果是真实的。

3）阴性对照：已知不表达目标蛋白的样品。其有助于检测非特异性结合和假阳性结果。

4）标准品：含有已知浓度的目标蛋白的样品，可从中获得标准曲线。

5）样本基质中的标准品（加标对照品）：加标对照可用来给出有关某种特殊样品基质中分析物发现程度的信息，从而表明检测性能。比如，在ELISA 中检测血清样品时，按照惯例标准品用正常稀释缓冲液来稀释。但可以同时用检测的种属血清来稀释标准品。

4、实验步骤（以Human IL-6 ELISA Kit – Absin，abs510003）

1）准备好所有需要的试剂和标准品；

2）从已平衡至室温的密封袋中取出微孔，未用的板条请放回铝箔袋内，重新封口；

3）向微孔板中加入300uL洗涤液，静置浸泡30s，弃掉洗液在吸水纸上将微孔板拍干，请立即使用不要让微孔板干燥；

4）分别将不同浓度标准品，实验样本或者质控品加入相应孔中，每孔100uL。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2h;

5）将板内液体吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自动洗板机洗板。每孔加洗涤液300uL，然后将板内洗涤液吸去。重复操作3次。每次洗板尽量吸去残留液体会有助于得到好的实验结果。最后一次洗板结束，请将板内所有液体吸干或将板倒置，在吸水纸拍干所有残留液体；

6）在每个微孔内加入100uL检测抗体。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2h；

7）重复第5步洗板操作；

8）在每个微孔内加入100uL SA-HRP，室温孵育20min。注意避光；

9）重复第5步洗板操作；

10）在每个微孔内加入100uL显色液，室温孵育5-30min，注意避光；

11）在每个微孔内加入50uL终止液，孔内溶液颜色会从蓝色变为黄色。如果溶液颜色变为绿色或者颜色变化不一致，请轻拍微孔板，使溶液混合均匀；

12）加入终止液后30min内，使用酶标仪测量450nm的吸光度值，设定570nm或630nm作为校正波长。如果没有使用双波长校正，结果准确度可能会受影响；

13）计算结果：将每个标准品和样品的校正吸光度值（OD450-OD540或OD570）、复孔读数取平均值，然后减去平均零标准品OD值。使用计算机软件作四参数逻辑(4-PL)曲线拟合创建标准曲线。另一种方法是，可以通过绘制标准品浓度做对数与相应OD值对数生成曲线，并通过回归分析确定最佳拟合线。这个过程可生成一个足够使用但不太精确的数据拟合。若样本经过稀释，计算浓度时应乘以稀释倍数。

ELISA操作小技巧

图2 ELISA操作小技巧

ELISA常见问题

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