在生物医学研究领域，多色荧光免疫组化(mIHC)和多色流式(FCM)是两种重要的技术，它们在检测和分析生物样本方面发挥着关键作用。尽管它们都涉及到荧光标记和多色分析，但它们的原理、样本选择、应用和优势却有着明显的区别。本文将为您详细解析这两种技术的不同之处。

原理与特点

多色荧光免疫组化技术(mIHC)，也称为酪氨酸信号放大(TSA)技术，是一种基于酪胺信号放大的多重顺次免疫染色技术。这项技术利用辣根过氧化酶(HRP)对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记，允许同时检测单个细胞或组织样本上的多个目标靶点。mIHC技术的优势在于其原位展示和定量分析的双重能力，能够全面研究细胞组成、功能和细胞间相互作用。

多色流式技术，即流式细胞术(FCM)，是一项集激光技术、光电测量技术、计算机技术、流体力学以及细胞免疫荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技细胞分析技术。FCM通过激光光源激发细胞上所标记的荧光物质的强度和颜色以及散射光的强度，对粒子进行多参数分析，包括粒子形状和大小、细胞周期、细胞内细胞因子、细菌表面抗原、细胞DNA内含物等。

样本要求

多色荧光免疫组化技术(mIHC)样本要求：

1、样本类型：mIHC通常使用福尔马林固定的蜡块或玻片，包括大块组织或组织芯片(TMA)。

2、组织固定：组织应使用10%中性福尔马林/多聚甲醛固定，正常固定时间为18-24h。

3、切片厚度：切片厚度约为4微米，使用防脱玻片。

4、样本保存：尽量选择相对较新的样本（一个月内），最长不要超过半年，以免靶点缺失或强非特异性导致染色效果不佳。

5、组织处理：取新鲜组织后迅速转移到固定液中，固定后浸蜡温度应控制在58~60℃左右。

6、玻片要求：组织需要紧贴玻片，避免褶皱，玻片不能有破损、划伤或污渍。

多色流式(FCM)样本要求：

1、样本类型：FCM需要单细胞悬液。外周血或悬浮生长的细胞可以直接制备成单细胞悬液，而贴壁细胞、实体组织或肿瘤组织需要先制备成单细胞悬液。

2、细胞活性：FCM检测的样本需要是活细胞，尤其是经过长时间运输和储存的样本，死细胞对许多抗体有非特异性染色，因此细胞活性检测非常重要。

3、样本保存：理想状态下，样本应在采集后立刻进行处理和染色。不同类型的抗凝剂对应的保存时间不同，例如肝素抗凝的血和骨髓可保存至48-72h/室温。

4、红细胞去除：在进行FCM分析前，可能需要去除红细胞，常用的方法包括红细胞裂解法和密度梯度离心法。

5、细胞与抗体比例：需要根据不同样本调整细胞与抗体的比例，以得到最适的细胞/抗体比例。

应用和优势

mIHC技术在肿瘤微环境、肿瘤免疫浸润、细胞衰老/凋亡/铁死亡/细胞自噬等领域有着广泛的应用。它能够通过定量病理分析获得组织细胞原位各种靶标类别、组分、表达量等信息，以及各靶标及其相互作用的空间定位、定性和定量等信息。

1、肿瘤微环境研究：mIHC技术可以同时获取组织的肿瘤标记物、细胞状态、免疫细胞分型、免疫调控、间质细胞等信息，对肿瘤免疫特征的全貌进行分析。例如，在肿瘤免疫浸润和趋化因子受体表达研究中，mIHC技术能够展示不同细胞之间的原位相互作用，这对于理解肿瘤微环境及药效评估尤为重要。

2、肿瘤免疫治疗药效评估：mIHC在评估抗PD-1/PD-L1治疗反应中显示出更高的准确性。相比于单指标IHC、TMB和GEP等评估方式，mIHC方法预测抗PD-1/PD-L1治疗的反应更准确，提供了更高的曲线下面积(AUC)。

3、减少组织样本损耗：mIHC技术可以在单个切片中标记多个标志物，减少样本损耗，特别适用于临床珍贵样本或穿刺等小组织量样本。

FCM技术在细胞生物学、分子生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、遗传学等多个领域有着广泛的应用。它能够进行细胞大小、细胞颗粒度、DNA及RNA含量、蛋白质含量、细胞特异抗原、细胞活性、胞内PH值、细胞周期、细胞凋亡、细胞功能分析等的检测。

多色流式(FCM)的应用：

1、肿瘤细胞参数检测：FCM可以检测肿瘤细胞的增殖活性标志分子、分化/凋亡标志分子等，用于研究肿瘤的发病机制、制定个性化治疗方案以及进行预后判断。例如，通过FCM检测细胞DNA含量，可以作为细胞发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变的重要标志。

2、微小残留病变(MRD)监测：FCM在恶性血液病MRD监测中具有高敏感性和特异性，已成为临床疗效观察和预后分层的重要依据。

3、肿瘤免疫状态评估：FCM通过TBNK分析精准评估肿瘤患者的免疫状态，有助于早期诊断恶性肿瘤，进而为患者后续的治疗提供指导和依据。

总结

总的来说，mIHC和FCM在生物医学研究中扮演着不同的角色。mIHC技术侧重于组织层面的多靶点分析，强调原位展示和定量分析，适用于研究细胞组成、功能和相互作用。而FCM技术则侧重于单个细胞的多参数分析，适用于细胞生物学和免疫学等领域的研究。了解这两种技术的区别，可以帮助科研人员根据研究需求选择合适的技术平台。

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