3D 免疫细胞迁移
时间：2022-06-15 阅读：676
介绍
细胞迁移是胚胎早期发育和免疫细胞反应等生物学现象的重要过程。在炎症发生过程中，T细胞通过血管系统向炎症部位募集是一个重要的阶段。这些T细胞被不同的细胞因子招募，如促炎细胞因子(TNFα， IFN-γ)和趋化因子。在被募集和粘附到内皮细胞后，T细胞需要通过一个称为穿内皮迁移(TEM)的过程跨越血管壁迁移到炎症组织。此过程需要活体组织复杂的3D环境对其成功导航，并通过重塑胞外基质（ECM）或改变细胞形状来挤压致密结构来完成。
在本研究中，我们利用MIMETAS ' OrganoPlate®3-Lane 40开发了一种体外实验，以研究灌注条件下与血管结构相结合的T细胞动力学。将人原代T细胞置于血管腔中，研究在各种因素存在与否的情况下，随后外渗和迁移到邻近的ECM的情况。我们用高内涵进行成像来观察细胞在不同时间点的迁移情况。这里，我们介绍了成像和图像分析方法用于量化在不同浓度的促炎细胞因子作用下进行跨内皮细胞迁移的细胞数量。
优势
创建易于规模化的、与高内涵兼容的复杂的细胞迁移分析
进行免疫细胞动力学的定量评估，大量得到分析数据如细胞数量和细胞迁移距离
材料
• OrganoPlate platform(MIMETAS)
• Endothelial cell source
• CD3+ T cells
• AIM V media (Invitrogen, 12055091))
• Collagen I 5 mg/mL (AMSbio Cultrex 3D collagen I rat tail, 5 mg/mL, #3447-020-01)
• 1M HEPES (Life Technologies 15630-122)
• 37g/L NaHCO3 (Sigma S5761-500G)
• PBS (Sigma)
• CellTracker Orange CMRA (Invitrogen, C34551)
• CD3/CD28 Human T-activators DynaBeads(Gibco, 11161D)
• TNFα (R&D systems, 210-TA-020)
• Chemokine trigger
• Image Xpress Micro Confocal(Molecular Devices)
• MetaXpress Software，version 6.6(Molecular Devices)
方法
Figure 2. 图像采集与分析工作流程。A) ImageXpress高内涵筛选系统(Molecular Devices)。B) MetaXpress自定义模块编辑器用户界面。图像处理步骤显示在页面左边，当前步骤的图像和结果的预览显示在右边，完整的工作流显示在底部的缩略图中。
结果
无论CD3+ T细胞受刺激与否，均能观察到细胞的跨内皮迁移(TEM)。两类细胞均能观察到时间依赖性效应，尽管在未受刺激的条件下有更明显的趋势(图4B和4C)。在受刺激的条件下，在24小时的时间点几乎没有观察到TEM的增加，而在未受刺激的条件下，在24小时和48小时的时间点观察到受TNFα剂量依赖性的细胞迁移。在48h时间点，受刺激的T细胞发生跨内皮迁移的总数量明显大于未受刺激的组。TEM似乎是由非刺激条件下TNFα介导的效应和刺激条件下的刺激本身驱动的。
Figure 3.
为高通量图像分析进行自定义模块编辑器设置。A)展示了用于识别T细胞类群的主要步骤。利用细胞核计数应用模块检测图像中的所有细胞。识别结果通过位置(质心Y)和区域进行过滤，以更准确地识别ECM通道内的细胞。如果需要，可以再加入位置的附加过滤，根据细胞向底部通道的迁移程度进行分类。具体的测量参数，包括细胞数，面积，强度，圆度，也可以通过测量参数选项卡选择。B)内皮血管与CD3+ T细胞的相差图像。C)当前样品的Cy5荧光信号，放大图。D) CME分析结果显示位于ECM通道中CD+ T细胞的分割覆盖。蓝绿色标记的细胞位于ECM通道的上半部分，黄色标记的细胞位于ECM通道的下半部分。检查图像是否存在可能被分割算法错误识别的成像伪影。
Figure 4. 有/无预刺激的T细胞在TNFα作用后的迁移响应。A)未受刺激的T细胞在TNFα作用0小时、4小时、24小时、48小时的图像。观察到内皮细胞屏障对面的细胞数量随着时间的推移在增加。B) TNFα作用下，受刺激T细胞的迁移数量。C) TNFα作用下，未受刺激T细胞的迁移数量。x轴显示TNFα的作用浓度，以pg/ml为单位。
结论
总之，我们利用高通量微流控平台开发了一种新颖的3D T细胞外渗和迁移实验。使用高内涵，可以精确提取和评估不同条件下单个T细胞的迁移行为。此迁移实验捕捉了在灌流下T细胞对血管内皮的附着，并由血管壁外渗到下面的组织中。该实验不受人工膜的影响，并允许3D ECM样支架和多细胞的共培养，这是模拟体内环境的关键要求。我们相信，该实验将提高目前对T细胞迁移行为的认识，并可以带动免疫肿瘤学和自身免疫领域新疗法的发展。
• OrganoPlate platform(MIMETAS)
• Endothelial cell source
• CD3+ T cells
• AIM V media (Invitrogen, 12055091))
• Collagen I 5 mg/mL (AMSbio Cultrex 3D collagen I rat tail, 5 mg/mL, #3447-020-01)
• 1M HEPES (Life Technologies 15630-122)
• 37g/L NaHCO3 (Sigma S5761-500G)
• PBS (Sigma)
• CellTracker Orange CMRA (Invitrogen, C34551)
• CD3/CD28 Human T-activators DynaBeads(Gibco, 11161D)
• TNFα (R&D systems, 210-TA-020)
• Chemokine trigger
• Image Xpress Micro Confocal(Molecular Devices)
• MetaXpress Software，version 6.6(Molecular Devices)
方法
模型
为了评估灌注条件下与血管结构相结合的T细胞动力学，我们在OrganoPlate 3通道中培养了一根内皮血管。在顶部灌注通道中，内皮细胞以10,000个细胞/芯片的密度接种在I型胶原细胞外基质(ECM)上。附着后在灌注条件下保持培养，在灌注通道内生成3D微血管。微血管的炎症状态通过以剂量依赖性方式添加促炎细胞因子TNFα来模拟，诱导内皮细胞粘附，参与内皮细胞的跨内皮迁移。在这个模型中，通过在3通道有机板的底部通道中加入趋化因子，得到一个趋化因子梯度 。CD3+T细胞使用CD3/CD28人T细胞激活剂Dynabeads刺激或未刺激48小时后，标记细胞，可以实时跟踪T细胞从内皮血管外渗到邻近的细胞外基质过程。
Figure1.
T细胞灌注内皮芯片模型的建立。A)示意图显示了OrganoPlate®3-Lane 40的40个微流控芯片之一，包括三个通道:两个介质灌注通道和中间的凝胶通道，每个通道由Phaseguides™分隔。这些通道连接在芯片的中心，被观察窗口(OW)覆盖。B)建立免疫细胞灌注内皮芯片模型的细胞种植方案示意图。
T细胞灌注内皮芯片模型的建立。A)示意图显示了OrganoPlate®3-Lane 40的40个微流控芯片之一，包括三个通道:两个介质灌注通道和中间的凝胶通道，每个通道由Phaseguides™分隔。这些通道连接在芯片的中心，被观察窗口(OW)覆盖。B)建立免疫细胞灌注内皮芯片模型的细胞种植方案示意图。
Figure 2. 图像采集与分析工作流程。A) ImageXpress高内涵筛选系统(Molecular Devices)。B) MetaXpress自定义模块编辑器用户界面。图像处理步骤显示在页面左边，当前步骤的图像和结果的预览显示在右边，完整的工作流显示在底部的缩略图中。
实验准备
培养CD3+ T细胞，部分组使用人T细胞激活剂Dynabeads刺激48小时。
成像和分析
使用ImageXpress®Micro共聚焦系统(Molecular Devices)固定时间间隔拍摄T细胞外渗和组织的图像。采用10倍空气物镜(0.45NA)和60μm共聚焦转盘以0.69x0.69x3µm/pixel (XYZ)的分辨率获取Z轴的荧光图像。然后图像沿z轴做了投影，创建了图片的最大荧光强度投影(MIPs)。
然后对所有图像使用MetaXpress软件(Version 6.6, Molecular Devices)定制模块编辑器(CME)自定义分析方法进行分析(图3)。简单地说，CME包含细胞核计数应用模块，在该模块中，T细胞根据大小和与背景的荧光差值被识别。一系列分析步骤被用来识别迁移至ECM通道的细胞群(图2)。每个实验都对ECM通道的位置进行精准识别，以校正不同板之间和板加载时的位移变化。
培养CD3+ T细胞，部分组使用人T细胞激活剂Dynabeads刺激48小时。
成像和分析
使用ImageXpress®Micro共聚焦系统(Molecular Devices)固定时间间隔拍摄T细胞外渗和组织的图像。采用10倍空气物镜(0.45NA)和60μm共聚焦转盘以0.69x0.69x3µm/pixel (XYZ)的分辨率获取Z轴的荧光图像。然后图像沿z轴做了投影，创建了图片的最大荧光强度投影(MIPs)。
然后对所有图像使用MetaXpress软件(Version 6.6, Molecular Devices)定制模块编辑器(CME)自定义分析方法进行分析(图3)。简单地说，CME包含细胞核计数应用模块，在该模块中，T细胞根据大小和与背景的荧光差值被识别。一系列分析步骤被用来识别迁移至ECM通道的细胞群(图2)。每个实验都对ECM通道的位置进行精准识别，以校正不同板之间和板加载时的位移变化。
结果
无论CD3+ T细胞受刺激与否，均能观察到细胞的跨内皮迁移(TEM)。两类细胞均能观察到时间依赖性效应，尽管在未受刺激的条件下有更明显的趋势(图4B和4C)。在受刺激的条件下，在24小时的时间点几乎没有观察到TEM的增加，而在未受刺激的条件下，在24小时和48小时的时间点观察到受TNFα剂量依赖性的细胞迁移。在48h时间点，受刺激的T细胞发生跨内皮迁移的总数量明显大于未受刺激的组。TEM似乎是由非刺激条件下TNFα介导的效应和刺激条件下的刺激本身驱动的。
Figure 3.
为高通量图像分析进行自定义模块编辑器设置。A)展示了用于识别T细胞类群的主要步骤。利用细胞核计数应用模块检测图像中的所有细胞。识别结果通过位置(质心Y)和区域进行过滤，以更准确地识别ECM通道内的细胞。如果需要，可以再加入位置的附加过滤，根据细胞向底部通道的迁移程度进行分类。具体的测量参数，包括细胞数，面积，强度，圆度，也可以通过测量参数选项卡选择。B)内皮血管与CD3+ T细胞的相差图像。C)当前样品的Cy5荧光信号，放大图。D) CME分析结果显示位于ECM通道中CD+ T细胞的分割覆盖。蓝绿色标记的细胞位于ECM通道的上半部分，黄色标记的细胞位于ECM通道的下半部分。检查图像是否存在可能被分割算法错误识别的成像伪影。
Figure 4. 有/无预刺激的T细胞在TNFα作用后的迁移响应。A)未受刺激的T细胞在TNFα作用0小时、4小时、24小时、48小时的图像。观察到内皮细胞屏障对面的细胞数量随着时间的推移在增加。B) TNFα作用下，受刺激T细胞的迁移数量。C) TNFα作用下，未受刺激T细胞的迁移数量。x轴显示TNFα的作用浓度，以pg/ml为单位。
结论
总之，我们利用高通量微流控平台开发了一种新颖的3D T细胞外渗和迁移实验。使用高内涵，可以精确提取和评估不同条件下单个T细胞的迁移行为。此迁移实验捕捉了在灌流下T细胞对血管内皮的附着，并由血管壁外渗到下面的组织中。该实验不受人工膜的影响，并允许3D ECM样支架和多细胞的共培养，这是模拟体内环境的关键要求。我们相信，该实验将提高目前对T细胞迁移行为的认识，并可以带动免疫肿瘤学和自身免疫领域新疗法的发展。