简介

对于监测细胞数目、繁殖、健康、融合度和细胞毒性的多种生物学应用，需要进行无标记细胞检测。这些应用需要使用有效和可靠的透射光(TL)成像和分析功能，此功能可提供精确分割以定量细胞并评估各种细胞反应和形态。此外，高对比度透射光成像与荧光标记成像的结合对于许多基于细胞的检测分析来说是非常重要的。

MetaXpress 6.5自定义模块编辑器中的TL 细胞分割算法是一种使用透射光对细胞进行成像及定量的优化且可靠的分析算法。此应用说明展示了TL细胞分割的实用性和准确性。通过将透射光中的总细胞计数与荧光染色的细胞核计数进行比较来分析和定量 CHO和HeLa细胞的算法（图 1）。

方法

将CHO和HeLa细胞稀释液接种到黑色、底部透明的96孔板中，从板顶行开始布板（最顶行中每孔20，000个细胞）。将每种细胞按1：2的比例在微孔板中向下进行稀释，6个复孔。细胞培养24小时后，在 37°C、5% CO2 的培养箱中用Hoechst 33342细胞核染料对细胞染色30分钟。然后用4%多聚甲醛固定细胞，并用DPBS洗涤两次。通过ImageXpress® Micro高内涵成像系统和MetaXpress软件对细胞进行成像。使用10x Plan Fluor物镜对一个视野进行成像，该物镜可准确捕获多达1500个细胞。使用透射光和DAPI荧光通道拍摄图像，曝光时间分别为15 ms和35 ms。

优势

使用
透射光成像对目标物进行分割和计数监测透射光下的细胞增殖

使用多种分析方法评估TL细胞分割算法的效果

了解多种细胞类型和大小的量化工具
定量和分析工具

图 1：设置用于分析透射光下拍摄的HeLa和CHO细胞图像的自定义模块。 使用Hoechst 33342细胞核染料对细胞进行染色。使用DAPI通道和透射光 (TL) 进行细胞成像，设置自定义模块以根据透射光成像和细胞核荧光成像分析和定量细胞。

在自定义模块编辑器中设置TL细胞分割算法

精准的细胞分割对于定量通过透射光捕获的细胞而言非常重要。为TL细胞分割选择的细胞算法A可以精确地分割和识别HeLa和CHO细胞 （图 2）。还有其他设置可供选择。细胞算法B或细胞算法C可分别用于分析小细胞或大细胞。在分析模块中进行设置可以过滤总面积小于150 pM2的细胞（图 3）。这个设置可以确保避免将围拢的小型死细胞当做活细胞进行计数和分析。此外，经过设置的细胞核计数算法可以准确定量HeLa和CHO的细胞核（图 4）。

结合透射光下的细胞计数与荧光胞核计数

使用TL细胞分割算法设置的自定义模块可精确分割HeLa和CHO 细胞（图 6）。透射光中的总细胞计数和细胞核计数没有统计学差异，表明TL细胞分割算法的准确性（图 7）。除细胞计数外，TL细胞分割算法还可生成多个数据以评估细胞反应和细胞形态的不同特征（图 5）。例如，可生成细胞和细胞内目标物的总计数和平均计数、面积、强度、形状、高度、宽度以及各种其他不同的读数。使用过滤器选项去除围拢的死细胞可进一步优化此过程，并减少使用活细胞或全细胞染色的必要性。此外，细胞核染色和计数细胞核对象算法的使用展现了可通过分析透射光成像。

图 2. 将TL细胞分割算法应用于选定的HeLa细胞透射光图像。在自定义模块编辑器中，可以通过设置选择源波长和代表细胞类型对TL细胞分割算法进行配置。细胞算法A可以有效地识别图像中的HeLa和CHO细胞。

图 3. TL细胞分割叠加和过滤器设置筛选后叠加的比较图像。 将最小面积设置为150 μm2以过滤掉死细胞。

图 4. 使用细胞核对象分割模块对荧光细胞核图像进行计数。根据细胞核对细胞进行定量，使用Hoechst 33342对细胞核进行染色。对超过局部背景参数的最小和最大宽度估值和强度进行优化，以精准识别所有细胞核。细胞核为蓝色（左图），分析遮蔽为黄色（右图）。

图 5. HeLa细胞的代表性图像，设置自定义模块图像分析方法。 蓝色遮蔽代表通过TL细胞分割算法使用TL过滤器遮蔽筛选发现的细胞，黄色代表通过计数核对象算法发现的细胞核。自定义模块的所需测定项可在测定选项卡中进行设置。需要测定的对象被定义为可以通过TL细胞分割算法进行遮蔽的对象，选择计数核对象遮蔽测定每个目标物的特性。

图 6. HeLa和CHO细胞的图像，以及应用TL细胞分割自定义模块优化后的图像分析结果。DAPI 细胞核以蓝色显示（左），在图像分析中掩膜为黄色（右），透射光中的细胞以浅蓝色掩膜。通过10x Plan Fluor物镜在ImageXpress Micro系统上捕获图像，并使用新TL细胞分割算法配置的自定义模块对图像进行分析。

图 7. 基于TL细胞分割和核计数对象模块比较HeLa和CHO细胞的总细胞计数。 按1：2的比例稀释细胞，从每孔20，000个细胞的浓度开始。

结论

MetaXpress自定义模块编辑器中的TL细胞分割算法可以有效定量和分析多种细胞类型和大小。ImageXpress® Micro Confocal转盘共聚焦高内涵成像分析系统支持的优化分割功能可分析与荧光团无关的细胞形态学。使用透射光图像定量细胞可以使研究人员的检测能力更加灵活。此应用说明描述的方法展现了TL细胞分割算法可用于多种检测，包括但不限于增殖、细胞毒性研究和转染。