3D 成像表征生物打印的卵巢癌模型
时间：2023-03-17 阅读：811
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美谷分子仪器（上海）有限公司 -
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简介
3D 生物打印被定义为细胞和生物相容性材料功能性 3D 结构或人工组织模型。1 这项技术改变了组织工程领域，使得创建复杂的预定义设计的结构成为可能，同时确保可重复性。几种基于 3D 生物打印的方法已报告用于工程化各种组织，如软骨、2 骨、3 以及皮肤再生。4 该技术也被用于创造新的临床前肿瘤模型。事实上，作为 2D 细胞培养模型由于缺乏预测性而受到越来越多的质疑， 3D 生物打印已成为一种替代方法通过处理不同的细胞和细胞外基质衍生分子，肿瘤微环境的建模 / 展示 (TME) 来规避这个问题。许多基于 3D 生物打印的肿瘤模型包括肺癌、5 乳腺癌和 6 胶质母细胞瘤。7 这些模型在设计方面表现出优势，与其他策略相比具有灵活性和可重复性如 细胞球和类器官。 卵巢癌是一个重大的公共卫生问题，3D 生物打印仍作为 卵巢癌模型仍在研究中。在此类肿瘤类型中，显示癌症相关成纤维细胞 (CAF) 与癌细胞发生密切相互作用，在癌症侵袭和耐药中发挥主要作用。8，9 因此 CAFs 是设计卵巢癌模型的关键。
优势
高内涵筛选和瞬时转染有助于表征和验证 3D 生物打印实验 • 瞬时基因表达是增加 3D 生物打印模型的多功能性的有力工具 • 多波长分析工具对于充分利用 3D 生物打印模型的强大功能进行研究不同细胞类型群体在模型内的相互作用是必需的在此应 用说 明 中，3D 生物打印用于创建包含癌细胞 ( SKOV3 细胞 ) 和 CAF 成纤维细胞 ( MeWo 细胞 ) 的卵巢癌模型。使用 jetOPTIMUS (Polyplus) GFP 质粒转染 SKOV3 细胞和并用 CellTracker 和 Orange CMRA Dye (ThermoFisher) 将 MeWo 细胞染色。两种细胞类型均包含在明胶 - 藻酸盐 - 基于水凝胶以获得用于形成圆柱形肿瘤样结构。模型的均相性以及这些肿瘤内细胞分布的可重复性，使用 ImageXpress Pico 进行评估成像系统。
结果和讨论
如图 1 所示，生物打印结构成像显示表达 GFP 的 SKOV3 细胞和荧光染色的 MeWo 细胞均质分布于明胶 - 藻酸盐 基体 ( 图 1A 和 B )。这非常重要，因为同质细胞分布均匀分布在生物墨水中是 3D 打印过程中需要考虑的重要因素 12 此外，天然 TME 是已知包含多种紧密相互作用的细胞类型。13 因此，重现这一点至关重要，同时构建体外肿瘤模型以促进癌症和基质细胞之间的相互作用。
而肿瘤中应结合多种细胞类型以更好地模拟 TME 异质 性，每种细胞类型的数量及其比例需要加以控制以确保可重复性。ImageXpress Pico 是一个特别适合用于实现此类控制，因其可以快速轻松地捕获多张显微镜图像。 软件 CellReporterXpress 允许对多个细胞进行定量即使是厚样品，也可使用 Z-stack 的最大投影实现。在此应用说明中，此系统用于分析我们的生物打印肿瘤模型在细胞数量和比例方面显示出良好的可重复性在 6 个生物打 印的结构，SKOV3 细胞的平均数量 ( 细胞计数 FITC ) 为 837 ± 200 ( 标准差 ≤ 25% )。对于 MeWo 细胞 ( 细胞计 数 TRITC )，平均数量为 3264.50 ± 462 (StD ≤ 15%)。
图 1 分析含有转染 GFP 质粒的 SKOV3 细胞和经 CellTracker Orange 染色的 MeWO 细胞的 3D 生物打印结构 CMRA 染料。A) 使用 ImageXpress Pico 系统 (4X，Z-stack) 采集的孔 B3 中 3D 生物打印结构的 FITC 和 TRITC 图像。B) 分析使用 CellReporterXpress 软件创建的 FITC 和 TRITC 细胞计数的 掩膜。C) 样品的 FITC 和 TRITC 通道中的平均细胞数量 (5 孔，染色和转染 ) 和阴性对照 (3 孔，未染色和未转染 )。D) 转染效率的评估，使用 GFP 质 粒和 jetOPTIMUS-Polyplus-transfection-transfection 试剂盒 (FITC 阳性细胞百分比 /TRITC 阳性细胞 )。
本应用说明展示了可视化可在生物打印中快速观察到特定基因结构。可实现瞬时基因表达，生物打印结构的特定细胞类型转染后再通过生物打印构建将其整合到 3D 中。这是 3D 生物打印相较于其他 3D 培养方法的一个显著的优势，例如已转染的细胞球和类器官的培养具有挑战性。 在这个初步实验中，转染效率估计为 25% (StD 3.48%) ( 图 1D )。还可以进一步优化，例如，通过使用 ImageXpress Pico 可筛选多个浓度转染混合物、DNA 质粒量和时间。该方法还提供了进行基因检测的可能性，基质和癌症中的沉默和 / 或基因编辑细胞。 总之，我们将转染、荧光成像和细胞计数结合以表征和验 证 3D 含癌细胞和 CAF 的生物打印卵巢肿瘤模型。我们可以证明两种细胞类型及其基质中的接近度，有利于细胞互动。这种方法为提供了创建具有受控且可重复的细胞分布的更复杂和完整的肿瘤模型的可能性，且没有在 3D 模型中观察到的染料渗透的局限性。因此，3D 生物打印肿瘤模型可以快速在整合到微流控系统。然后可以长时间培养在生理流下创造更多体内样抗癌药物开发的临床前模型。
材料和方法
水凝胶制备
对于水凝胶制备，所需质量的对明胶和海藻酸钠粉末进行称重，在紫外线下 1 小时，然后溶解在 Dulbecco 改 良 EagleMedium 中混合lowest必需培养基 (MEM)，补充有 10% 胎牛血清。所得溶液为然后在磁力搅拌下在 37℃ 下 保持过夜，complete均质化。 细胞转染和染色根据制造商的说明，使 用 jetOPTIMUS (Polyplus) GFP 质粒转染 SKOV3 细胞。10 简言之，适量的 DNA 稀释至 jetOPTIMUS 缓冲液并适当的加入 jetOPTIMUS 转染试 剂。转染溶液在室温下保存 10 分钟，然后添加到培养的 SKOV3 细胞中，以 60–80% 融合度培养在 T75 烧瓶中。 使 用 CellTracker Orange CMRA 染 料 (ThermoFisher) 对 MeWO 细胞进行染色，按照制造商的说明。11 简言 之，将染料溶解在 DMSO 中制备工作溶液，然后稀释在 MEM 培养基中。将细胞在 37℃ 孵育 30 分钟。 然后取出试剂溶液，替换为新鲜的complete培养基。
图 2 用于对卵巢癌模型结构进行生物打印和成像的方法示意图。
细胞包封
对于生物墨水制备，胰蛋白酶消化的细胞重悬于新鲜培 养基中并小心添加之前制备的聚合物溶液。获得的缓慢搅拌悬浮液以使细胞均质化的分布在生物墨水中。
生物打印工艺
对于生物墨水制备，胰蛋白酶消化的细胞重悬于新鲜培 养基中并小心添加之前制备的聚合物溶液。获得的缓慢搅拌悬浮液以使细胞均质化的分布在生物墨水中。
生物打印工艺
将制备好的生物墨水装入 3 mL 滤芯中并装入生物打印 头。生物打印在 24 孔板中进行。每个 3 毫升滤芯生物打 大约 48 种结构。生物打印后，使用 100 mM CaCl2 溶液 交联结构，补充新鲜培养基并在 37℃ 和 5% CO2 条件下 培养，直至实验。
细胞成像
将生物打印结构转移到 96 孔板中 ( Greiner 655892，玻 璃底，黑壁 )。 使用 ImageXpress Pico 自动细胞成像系统，使用 4X 物 镜对细胞进行成像。 通过透射光、FITC 和 TRITC 通 道 分 别以 5、150 和 250 ms 曝光时间在每个孔采集图像。4X 物镜显示约占孔总 面积的 40%。采用基于硬件和基于图像的自动对焦相结 合的方法，获 得了距离为 50 μm 的 7 个 Z 平面 (Z 层叠 加 )。最大二维投影图像是实时生成的。 Cell ReporterXpress 软件中预先配置的细胞计数分析模 块用于在 FITC 或 TRITC 通道中使用信号量化细胞。用 于分析的分割参数为强度、最小值和最大宽度。FITC 通 道的值为 23,7,100,TRITC 通道为 23,7,38。