注意：实验之前建议选择2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

货号：SH114W

规格：100T/96S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系作人员。

提取液：液体100 mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体5 mL×1瓶       ，4℃保存；

试剂二：液体25 mL×1瓶，4℃保存；

标准液：液体1 mL×1支，   4℃保存。标准液：丙酮酸钠，1 mg/mL。

 产品说明：

丙酮酸通过乙酰CoA连接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代谢，起着重要的枢纽作用。

丙酮酸与2,4-二xiao基苯肼作用，生成丙酮酸-2,4-二xiao基苯腙，在碱性溶液中呈樱红色。

自备仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL 提取液），超声波破碎（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次），静置30min，8000g，常温离心10min，取上清待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆，静置30min，8000g，常温离心10min，取上清待测。

3、血清（浆）样本：按照血清（浆）体积（mL）：提取液体积（mL）为1：5~10的比例（建议取0.1mL血清（浆）加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆，静置30min，8000g，常温离心10min，取上清待测。

二、操作步骤：

1、分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至520nm，蒸馏水调零。

2、标准品的准备：将标准品用蒸馏水稀释至25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125、0μg/mL。

3、在微量玻璃比色皿或96孔板中加入75μL标准液或样本和25μL试剂一，混匀，静置2min，加入125μL试剂二，混匀，于520nm波长处测定吸光值A。

三、丙酮酸含量计算：

1、根据标准品浓度和测定值建立标准曲线；x为丙酮酸钠含量（μg/mL），y为吸光值。

2、按照血清（浆）体积计算

丙酮酸含量（μg/mL）= (x×V1)÷[V1÷(V2+V3)×V3]=11x

3、按照样本蛋白浓度计算

丙酮酸含量（μg/mg prot）=(x×V1)÷(V1×Cpr)=x÷Cpr

4、按照样本质量计算

丙酮酸含量（μg/g 质量）= (x×V1)÷(W×V1÷V2)=x÷W

5、按照细菌或细胞数量计算

丙酮酸含量（μg/104 cell）=(x×V1)÷(500×V1÷V2)= x÷500

V1：加入反应体系中样本体积，0.075mL；V2：加入提取液体积，1mL；V3：加入血清（浆）体积，0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

注意事项：

如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。

技术指标：

zui低检出限：0.1510 μg/mL

线性范围：0.78125-50 μg/mL

参考文献：

[1] Venkatesh C, Ramalingam K. Lactic acid, pyruvic acid and lactate/pyruvate ratio in the Anoplocephalid tapeworm Stilesia globipunctata infecting sheep (Ovis aries)[J]. Veterinary parasitology, 2007, 144(1-2): 176-179.

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