羧基活化的琼脂糖可用于固定含胺分子。耦合化学是基于碳二亚胺的，是一项成功且有据可查的技术。

羧基活化琼脂糖色谱填料(Carboxyl-activated SepFast)与含有伯胺基团的配体形成化学稳定的酰胺键，它有一个长间隔区（9个原子）。预活化的琼脂糖基质可以用于制作各种定制的亲和色谱填料，适用于小规模和大规模纯化应用。

1. 属性

羧基活化琼脂糖色谱填料(Carboxyl-activated SepFast 4HF)由高度交联的4%珠状琼脂糖制成。它具有高机械刚度，可在降低背压的情况下实现高流量。

由于琼脂糖具有出色的亲水性和低非特异性结合特性，长期以来一直用于色谱分离。这些颗粒具有开孔结构，对大蛋白质分子具有出色的传质性能。

通过将长的亲水性间隔臂连接到骨架上来活化基础基质。它直接与分子中的伯胺基反应，在碳二亚胺试剂存在下被固定。羧基活化琼脂糖色谱填料(Carboxyl-activated SepFast)以20%乙醇中的水悬浮液形式提供。

表1  羧基活化琼脂糖色谱填料(Carboxyl-activated SepFast 4HF)的特性

2. 配体固定化

以下是配体一般的偶联流程。

2.1  将目标配体溶解在偶联缓冲液中，将pH值调整为4.5。偶联缓冲液的体积可以是固定凝胶体积的一半或相同。

2.2  在过滤装置中用至少5 倍体积的偶联缓冲液清洗羧基活化凝胶。

2.3  将洗净并吸干的凝胶（来自步骤 2.2）转移到步骤2.1 制备的溶液中。

2.4  将碳二亚胺作为干粉或预先溶解的溶液添加到浆液中，最终浓度为0.1 M。如果碳二亚胺预先溶解在水中，则将pH值调整为4.5。

2.5  在室温或4-8℃下混合浆料。

2.6   在第1个小时内通过添加 0.1  M NaOH调节反应pH值至4.5。

2.7 将偶联反应放置2-24小时。

2.8 用5倍体积的0.1 M 醋酸盐缓冲液 + 0.5 M NaCl，pH 4.0洗涤凝胶，然后用5倍体积的0.1 M Tris/HCl + 0.5 M NaCl，pH 8.0洗涤凝胶。重复上述洗涤2次以上。

2.9 使用前用工作/平衡缓冲液清洗凝胶。

3. 固定化效率的一般考虑

3.1 pH

偶联反应在pH 4.5 - 7.5之间非常有效地进行。但是可以优化偶联pH以获得最佳结果（例如，高偶联产率和高配体活性）。

在偶联反应的第1个小时内，pH值会降低。要记得通过添加0.1 M NaOH来调节偶联pH值。之后pH值会趋于稳定。

3.2 偶联方案

去离子水可直接用作偶联溶液。应避免使用含有氨基、巯基或羧基的缓冲溶液，因为它们会与配体偶联发生竞争。

可以引入稀释的某些有机溶剂以提高配体的溶解度。应事先测试此类溶剂的适用性。

3.3 碳二亚胺的选择

应使用水溶性碳二亚胺，例如1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺  (EDC)  或1‑环己基‑3‑(2‑吗啉代乙基) 碳二亚胺  (CMC)（通常合成为 metho‑p‑甲苯磺酸盐）。EDC是常用的碳二亚胺试剂。

3.4 碳二亚胺的浓度

添加的碳二亚胺的量应以化学计量的方式超过活化的羧基。建议以最终反应浆料中的0.1  M作为起点。

3.5 反应时间和温度

可以优化偶联过程中配体和活化填料之间的接触时间以保持配体的生物活性。

典型的反应时间是在室温或冷藏室中过夜。

3.6 屏蔽剩余的活化配体

如果加入过量的配体，则可能不需要封闭残留的活化基团。

未与配体反应的活化基团应在碳二亚胺存在下通过添加额外的含有pH 8 - 9伯胺的小分子（例如1 M乙醇胺）来封端。

3.7 最终填料的洗涤

偶联反应后需要将未连接或弱连接的配体WAN全洗掉。采用高pH值和低pH值交替的洗涤方法可以确保有效去除不需要的物质。

4. 固定化亲和填料的使用

配体偶联填料可用于使用间歇搅拌罐模式或填充柱模式的纯化。处理这种材料遵循与处理其他基于琼脂糖基质相同的原则。

5. 储存

羧基活化琼脂糖色谱填料(Carboxyl-activated SepFast)应在8℃下储存。偶联的湿填料应在防菌剂（例如20%乙醇）存在的情况下于4-8℃储存。切勿冻存耦合填料。

6. 更多信息

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