醛基活化琼脂糖基质在制备和使用定制亲和色谱填料方面具有良好的记录。将生物特异性配体与醛基活化琼脂糖偶联是一项成功且有据可查的技术。

醛基活化琼脂糖色谱填料(Aldehyde-activated SepFast)通过还原胺化反应与含有伯胺基团的配体形成化学稳定的仲胺键。这种预活化的琼脂糖基质可用于亲和色谱填料的定制，适用于小规模和大规模纯化应用。

1. 属性

有2种基质可供选择，适合各种待偶联或纯化的分子。

• 醛基活化琼脂糖色谱填料(Aldehyde-activated SepFast 4 High Flow)由高度交联的4%珠状琼脂糖组成。其大孔径适用于偶联或纯化大分子。它具有高机械刚度，可在降低背压的情况下实现高流量。

• 醛基活化琼脂糖色谱填料(Aldehyde-activated SepFast 6 High Flow)由高度交联的6%珠状琼脂糖组成。其适中的孔径适用于偶联较小的分子。它也具有高机械刚度，可在降低背压的情况下实现高流量。

由于琼脂糖具有出色的亲水性和低非特异性结合特性，长期以来一直用于色谱分离。这些颗粒具有开孔结构，对各种分子具有出色的传质性能。基质通过氧化被激活以产生醛基，它直接与分子中的伯胺基反应，在还原剂存在的情况下被固定化。

醛基活化琼脂糖色谱填料(Aldehyde-activated SepFast)以20%乙醇中的水悬浮液形式提供。

表1  醛基活化琼脂糖色谱填料(Aldehyde-activated SepFast)的特性

2. 配体固定化

以下是一般的配体偶联程序。

2.1  将目标配体溶解在偶联缓冲液中，0.1 M磷酸钠，pH 7.0。一般对于蛋白质配体，凝胶的制备浓度为5 - 20 mg/ml。对于小配体，凝胶的制备浓度为10 - 100  µmol/ml。偶联缓冲液的体积可以是固定凝胶体积的一半或相同。

2.2  在过滤装置中用至少5 倍体积的偶联缓冲液清洗醛活化凝胶。

2.3  将洗净并吸干的凝胶（来自步骤  2.2）转移到步骤  2.1 制备的溶液中。

如果发生变化，请调整 pH 值。

2.4  将浆液在通风良好的通风橱中在室温下混合 2‑4 小时。

2.5  将氰基硼QING化钠（0.5 g/100 ml  活性凝胶）加入浆液中，过夜。注意：氰基硼qing化钠有毒，应格外小心处理。

2.6  用至少 5 倍凝胶体积的偶联缓冲液清洗凝胶。

2.7 在氰基硼QING化钠存在下，将凝胶重新悬浮到相同体积的封闭溶液，0.1 M Tris/HCl，pH 8.0或1 M乙醇胺，pH 8.0中2-3小时。

2.8 用5倍体积的0.1 M Tris/HCl + 1 M NaCl，pH 8.0 洗涤凝胶，然后用5倍体积的0.1 M醋酸盐缓冲液 + 1 M NaCl，pH 4.0洗涤凝胶。

2.9 使用前用工作/平衡缓冲液清洗凝胶。

3. 固定化效率的一般考虑

3.1 pH

还原胺化可以在pH 4 - 10之间非常有效地进行。但是可以优化偶联pH以获得最佳结果（例如，高偶联产率和高配体活性）。

在配体溶解后要注意调整偶联 pH 值。

3.2 偶联方案

应避免使用含有氨基的溶液。

可以引入稀释的某些有机溶剂以提高配体的溶解度。应事先测试此类溶剂的适用性。

耦合溶液的体积与活化凝胶的体积保持一致。建议使用0.5-1 : 1 v/v的理想比例。

3.3 盐

偶联缓冲液中盐的存在（例如0.5  M 或饱和）可以提高固定效率。

3.4 基础基质中的活化基团

对于某些配体或应用，基础基质中的活化水平可能过高，偶联配体的活性可能会降低。

在降低的 pH 值下偶联可能会减少配体分子的连接点。它可以提高偶联配体的活性。活化基团的受控封闭，例如在添加配体前几个小时用  5‑10  mM  封闭缓冲液孵育凝胶，也可以减少过度偶联问题。

3.5 反应时间

可以优化偶联过程中配体和活化填料之间的接触时间以保持配体的生物活性。

3.6 还原剂的选择

其他还原剂如硼QING化钠可用于偶联反应。氰基硼氢化物是一种较温和的还原剂，它只还原醛基和伯胺基之间形成的中间席夫碱，得到稳定的仲胺键。硼氢化物是一种更强的还原剂，可还原席夫碱和未偶联的醛基。

3.7 屏蔽剩余的活化配体

未与配体反应的活化基团应通过添加含有pH 8 - 9伯胺的额外小分子（例如 Tris 或乙醇胺）来封端。

3.8 最终填料的洗涤

偶联反应后需要将未连接或弱连接的配体WAN全洗掉。采用高pH值和低pH值交替的洗涤方法可以确保有效去除不需要的物质。

4. 固定化亲和填料的使用

配体偶联填料可用于使用间歇搅拌罐模式或填充柱模式的纯化。处理这种材料遵循与处理其他基于琼脂糖基质相同的原则。

5. 储存

醛基活化琼脂糖色谱填料(Aldehyde-activated SepFast)t应在8℃下储存。偶联的湿填料应在防菌剂（例如20%乙醇）存在的情况下于4-8℃储存。切勿冻存耦合填料。

6. 更多信息

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