CNBr活化磁性琼脂糖色谱填料是一种磁性琼脂糖树脂，可以用于制造各种磁性亲和色谱色谱填料，适用于小规模和大规模纯化应用。

CNBr活化磁性琼脂糖色谱填料在制备和使用定制亲和色谱填料方面具有良好的记录。将生物特异性配体与CNBr 活化的琼脂糖偶联是一种广泛使用、成功且有据可查的技术。偶联反应是自发的、快速的并且易于进行。不需要有毒化学品或特殊设备。

应用领域包括蛋白质、多肽和核酸的固定化。

1. 属性

CNBr活化磁性琼脂糖色谱填料(4 HF)由高度交联的4%磁性琼脂糖制成。它可以在更严苛的条件下操作使用，因此可以应用低pH值和某些高浓度有机溶剂。

由于琼脂糖具有出色的亲水性和低非特异性结合特性，长期以来一直用于色谱分离。这些颗粒具有开孔结构，对大蛋白质分子具有出色的传质性能。

基础基质与溴化氢（CNBr）反应生成活性基团，这些活性基团与待固定分子中的伯胺基团反应。CNBr活化磁性琼脂糖色谱填料以含有添加剂的冻干粉形式提供。

表1  CNBr活化磁性琼脂糖层析介(4HF)的特性

2. 配体固定化

2.1 培养基的预处理

CNBr活化磁性琼脂糖色谱填料以含有添加剂的冻干粉末形式提供。这些添加剂必须在偶联反应前洗掉。使用足够量的低 pH 洗涤液以保持反应基团的活性。

2.1.1 称取所需的粉末（1 g干粉提供约3 ‑ 5 ml固定体积的色谱填料）并将其悬浮在预冷的 1 mM  HCl中（1 g 干粉使用10  mL 1 mM  HCl）。让色谱填料在低温下膨胀30分钟。

2.1.2  在重力流或受控慢流下，在过滤装置中用冷的1  mM  HCl 清洗凝胶。所需酸的总体积为15到 20 个凝胶体积。洗涤后的色谱填料应立即用于以下偶联步骤。

2.2配体偶合

以下是一般的配体偶联程序。

2.2.1  将目标配体溶解在含有0.5 M NaCl的0.1 M NaHCO₃，pH 8.3的偶联缓冲液中。对于蛋白质配体，凝胶浓度为5-20 mg/ml。对于小配体，凝胶浓度为1-10 µmol/ml 。偶联缓冲液的体积应与固定凝胶的体积相同。

2.2.2  将洗净并吸干的凝胶（来自步骤  2.1.2）转移到上述溶液中。

2.2.3 浆液在4℃下混合过夜或在室温下混合3-4小时。

2.2.4  用至少5 倍凝胶体积的偶联缓冲液清洗凝胶。

2.2.5 将凝胶重新悬浮到相同体积的封闭溶液中，0.1 M Tris/HCl，pH  8.0 或1  M乙醇胺 pH  8.0，持续2 - 3小时。

2.8 用5倍体积的0.1 M Tris/HCl + 1 M NaCl，pH 8.0洗涤凝胶，然后用5倍体积的0.1 M醋酸盐缓冲液 + 1 M NaCl，pH 4.0洗涤凝胶。

2.9 使用前用工作/平衡缓冲液清洗凝胶。

3. 固定化效率的一般考虑

3.1 pH

pH 8.3的缓冲液常用于蛋白质固定。然而偶联pH值可在6-10之间进行优化以获得最佳结果（例如，高偶联产率和高配体活性）。

注意：配体溶解后要调节偶联pH值。

3.2 偶联方案

应避免使用含有氨基的溶液。

可以引入稀释的某些有机溶剂以提高配体的溶解度。应事先测试此类溶剂的适用性。

3.3 盐

偶联缓冲液加入盐可以提高固定效率。

3.4 基础基质中的活化基团

对于某些配体或应用，基础基质中的活化水平可能过高，偶联配体的活性可能会降低。

在降低的pH值下偶联可能会减少配体分子的连接点。它可以提高偶联配体的活性。活化基团的受控水解，例如在添加配体前几个小时用偶联缓冲液孵育凝胶，也可以减少过度偶联问题。

3.5 屏蔽剩余的活化配体

未与配体反应的活化基团应通过添加额外的含有pH 8 - 9伯胺的小分子（例如Tris或乙醇胺）来封端。

3.6 最终色谱填料的洗涤

偶联反应后需要将未连接或弱连接的配体WAN全洗掉。采用高pH值和低pH值交替的洗涤方法可以确保有效去除不需要的物质。

4. 固定化亲和色谱填料的使用

配体偶联色谱填料可用于使用间歇搅拌罐模式或填充柱模式的纯化。处理这种材料遵循与处理其他琼脂糖基质相同的原则。

5. 储存

冻干的CNBr活化磁性琼脂糖色谱填料应在8℃下储存。偶联的湿色谱填料应在防菌剂（例如20%乙醇）存在的情况下于4-8℃储存。切勿冻存耦合色谱填料。

6. 更多信息

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