全式金pEASY®-Blunt克隆试剂盒(CB101-01)包含LacZ基因，在含有IPTG和X-gal的平板培养基上，可进行蓝白斑筛选，适用于平端克隆。

全式金pEASY®-Blunt克隆试剂盒(CB101-01)的产品组分包括pEASY®-Blunt Cloning Vector、Control Template、Control Primers、M13 Forward Primer、M13 Reverse Primer、Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell等，

产品特点：

快速：仅需5分钟。

简单：加入片段即可。

高效：阳性率高。

提供氨苄青霉素和卡那霉素两种筛选标记，便于根据实验选择筛选标记。

测序引物：M13 Forward Primer，M13 Reverse Primer，T7 Promoter Primer。

T7 Promoter用于体外转录。

Trans1-T1感受态细胞转化效率高，生长速度快，确保克隆数，节约选时间。

操作方法：

1、PCR产物的制备

(1)引物要求:引物不能磷酸化。

(2)酶的选择:扩增产物为平端的高保真DNA聚合酶，如FasP/，KD Plus DNA Polymerase。

(3)反应条件:为了保证扩增产物的完整性，扩增反应需要5-10分钟后延伸。反应结束后，电泳检测PCR产物的量和质量如果扩增产物有多条带，建议凝胶回收目的片段。

2、克隆反应体系

(1)加入

(2)轻轻混合，室温(20℃-37℃℃) 反应5分钟。反应结束后，将离心管置于冰

3、推荐克隆反应条件

· 最佳插入片段DNA量

载体与片段摩尔比=1:7

可以粗略地按照“1 kb 20 ng”的比例计算。(如1 kb加20 ng、1.5 kb加30 ng等)

· 最佳载体使用量:1μl

· 最佳反应体系:3-5 m，体积不足时可以补充无菌水。

· 最佳反应时间

(1)片段长度为0.1-1kb(含1 kb):5-10 min

(2)片段长度为 1-2 kb(含2 kb):10-15 min

(3)片段长度为 2-3 kb(含3 kb):15-20 min

(4)片段长度为3 kb 以上:20-30 min

· 最佳反应温度:25℃，如片段是高GC含量，可以37℃反应。(推荐用PCR仪控温)

4、转化

(1) 加连接产物于50 m 7ans1-T1感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，轻弹混匀，冰浴20-30分钟。

(2) 42℃水浴热激30秒，立即置于冰上2分钟。

(3) 加250 ml平衡至室温的SOC或LB培养基，200rpm、37℃培养1小时。

(4) 取8u500 mM IPTG和40 wl 20 mg/mlX-gal混合，均匀地涂在准备好的平板上，37℃培养箱中放置30分钟。

(5)待IPTG和X-gal被吸收后，取200ml菌液均匀地涂在平板上，在37℃培养箱中过夜培养(为得到较多克隆，1.500xg离心1分钟，弃掉部分上清，保留100-150 m，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板)。

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