常见的RT-qPCR流程一般分为RNA提取，逆转录、荧光定量PCR三个步骤，当有的课题需要对某物种进行多种处理后，检测某个基因的表达水平，以验证该基因应对不同胁迫压力的耐受力；或者经某种病原菌侵染后，检测寄主不同基因的表达水平，以探究可能涉及的通路及互作机理等……对于这几类样本数量较大，但样本只需要检测一次的实验方案，我们常常推荐一步法RT-qPCR，即逆转录与荧光定量PCR配制一管体系，只需一次上机即可完成表达量的检测。

由于将RNA逆转录与荧光定量PCR的体系配制合为一步，那么对于实验操作的精准度及污染控制就极为重要，针对一步法RT-qPCR的特殊性，以下总结了一步法RT-qPCR实验优化小技巧可有效提高实验结果的稳定性及准确性。

1. 目的片段选择

①　选择80-200 bp扩增子可保证PCR扩增效率zui大化

②　片段GC含量建议控制在40% ~ 60%

③　避免扩增子与模板其他位置出现长片段的重复序列

④　避免扩增子出现二级结构

2. RNA模板制备

①　尽量选择高产量、高纯度的RNA提取试剂

②　RNA可以保存在含有EDTA溶液 (1 × TE) 中，EDTA可螯合金属离子来消除对RNase的催化作用，以此保证RNA的完整性

③　RNA提取后可以使用DNase I (ATG #E103) 消化基因组DNA残留

3. 引物设计

①　常规引物长度15-30 nt，理想的引物GC含量40-60%，Tm值尽量接近60℃，且上下游引物Tm值相差尽量3℃以内，避免4个重复性的碱基序列，尤其是4个G碱基

②　引物浓度按说明书推荐值添加，引物投入量过多，可能产生引物二聚体或非特异扩增，熔解曲线会出现杂峰

③　以cDNA为模板时，建议引物区域跨越内含子，这样减少以基因组DNA模板进行扩增的假阳性

4. 探针设计

①　常规探针长度15-30 nt，以保证荧光基团能够有效猝灭，GC含量保持40-60%

②　一般情况下，非荧光猝灭基团比荧光猝灭基团更有信噪比

③　避免5’端为G碱基，否则会猝灭荧光基团

④　设计的探针应该结合到正义链或反义链上

⑤　一般探针Tm值要比引物Tm值高5-10℃，保证引物结合前探针的全部序列与模板充分结合

5. 多重扩增

①　避免探针、引物之间及目的序列之间没有重叠序列

②　设计探针时，保证每个目的序列有唯yi的用于检测的荧光基团

③　根据实时定量PCR仪检测范围来选择荧光基团，荧光报告基团的发射光谱不能有重叠

④　在单重反应中检测每一组引物/探针组合，以设置一个基线标准，确保在多重PCR时Ct值接近

⑤　高丰度目的序列可搭配低强度荧光染料，低丰度目的序列则搭配高强度荧光染料

6. 逆转录

①　一般建议逆转录这一步的反应温度按照试剂说明书设置，对于具有复杂二级结构或高GC区域的模板，建议提高反应温度，有助于提升扩增效率和灵敏度。

7. 循环条件

①　一般情况下，按照说明书中的循环条件即可达到最佳效果

②　可以进行较长片段扩增 (>400 bp)，但可能需要优化延伸时间

③　对于大多数情况，40个循环是足够的，极低起始量的可以进行45个循环

8. 建立反应

①　为了达到最佳结果，在热循环之前请将反应体系放在冰上

②　对于96孔板，推荐使用20 μl反应体系。使用384孔板，推荐10 μl反应体系

③　每一个样本应设置三个重复，保证每一个扩增子包含阴性对照 (NTC)

④　为了避免交叉污染，热循环前加入热敏UDG，37℃处理10 min

9. 检测评估

①　确保至少三个10倍梯度稀释模板的扩增效率达到90-110%，相关系数（R2) 应>0.99

②　通过产物的长度、测序或熔解曲线分析确认其特异性

以上就是有关于一步法RT-qPCR实验优化小技巧的全部内容，如果你想了解更多请咨询百奥创新客服！