细胞冻存与复苏的常见问题

　　细胞冷冻保存是细胞保留的主要方式之一。借助冷冻技术，将细胞置于-196℃的液氮中，可使其暂时脱离生长状态并保持其细胞特性，以备日后在实验中复苏使用。这一方法不仅可以预防正在培养的细胞遭受污染或其他意外情况而导致种群丧失，同时也发挥了细胞保护的功效。那么你知道细胞冻存与复苏的常见问题吗？让我们一起来看看吧！

　　一、细胞冻存为什么要添加保护剂

　　细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术。

　　细胞在不加任何保护剂的情况下冷冻，细胞内外的水分会很快形成水晶从而引发一系列的不良反应：首先，部分蛋白质因局部电解质浓度增高和pH值改变而变性，导致细胞内部空间结构发生改变。其次，细胞内冰晶的形成和细胞膜系统上蛋白质，酶的变性等会限碍细胞的能量代谢。再次，胞膜上的类脂蛋白复合体在冷冻中易发生破坏引起胞膜通透性的改变，使细胞内容物丧失。最后，随着冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成DNA的空间结构发生损伤从而引起细胞死亡。添加冷冻保护剂可以很好的改善细胞的破坏与死亡情况。

　　二、冷冻管应如何解冻

　　从液氮中取出细胞置-80℃冰箱中数分钟，让管中液氮控发后，再放入37℃的水浴锅中(预防冻存管爆裂，冻存管内有液氮的话，直接放入37℃水浴锅中可能爆裂)。

　　轻摇冻存管使其最好在2min内全部融化，并注意水面不可超过冻存管管口，否则容易造成污染。

　　三、高效进行细胞冻存应该注意什么

　　1.缓慢冷冻：慢冻可使细胞逐步脱水，细胞不会因产生大的冰晶而受到损害。相反，细胞内若出现大结晶会引起细胞膜、细胞器的损伤和破裂。

　　2.细胞活力及浓度：细胞应在生长良好、培养瓶致密度约为80-90%、活力达90%以上的状态下冻存。细胞活力差的细胞在冻存后的成活率很小，因此，一定要在细胞旺盛分裂时期冻存。

　　3.冻存密度：冻存时细胞密度少于5x105个活细胞/mL时，很难成功复苏。

　　4.冻存管盖子：冻存管的盖子一定要拧紧，否则水浴复苏时水会渗入造成污染。

　　5.冻存时间：细胞不可长期保存在-80℃冰箱中。建议在-80℃冰箱中的保存时间不要超过48h（一般只需要12小时过夜即可）。

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