在上篇MLPA试验原理中，我们已经详细介绍了MLPA技术。MLPA，即多重连接探针扩增技术，是一种分子生物学技术，用于检测基因的拷贝数变异和序列变异。它结合了PCR（聚合酶链式反应）和连接酶技术，通过设计特定的探针来识别和扩增目标DNA序列。下面让我们一起来看看MLPA的试验步骤吧！

MLPA试验步骤分为六步：变性、杂交、连接、PCR扩增、片段分离、数据分析。

一、变性

将DNA标本放入PCR仪中加热5分钟，使DNA双链解链成单链。纯化的样本DNA被变性。

二、杂交

加入杂交反应液。杂交反应液包含SALSA MLPA探针混合液和SALSA MLPA缓冲液。每组MLPA探针混合物包含多达60对不同的MLPA探针，每个探针识别一个特异的靶序列。MLPA探针由两部分组成:左探针和右探针寡核苷酸(LPO和RPO)。LPO和RPO包含PCR引物和DNA杂交序列。在MLPA反应中，左探针寡核苷酸（LPO）和右探针寡核苷酸（RPO）都与靶序列进行杂交。

三、连接

实验第二天，加入连接酶反应液。反应液包括连接酶缓冲液A，连接酶缓冲液B和SALSA连接酶Ligase-65。连接酶Ligase-65结合到与靶序列杂交的左侧探针和右侧探针上，催化产生一个共价键。随后，通过加热反应液使连接酶失活，从而终止连接步骤。连接酶Ligase-65特异性非常高，只要杂交区域有一个核苷酸错配，连接酶就不会连接两段探针，使连接反应具有高度特异性。正是由于这种高特异性，MLPA也可以用于区分序列高度相似的假基因，以及检测特定的点突变。

四、PCR扩增

加入PCR聚合酶混合液。PCR聚合酶混合液包含SALSA PCR聚合酶及SALSA PCR引物混合液。PCR引物混合液中包含dNTPs、正向引物和反向引物。正向PCR引物带有荧光标记。所有连接上的MLPA探针均使用这对PCR引物进行指数扩增。PCR反应包含变性、引物复性以及引物延伸，循环35次。荧光标记被带入到MLPA扩增产物，即MLPA扩增子中。

五、片段分离

扩增后，用毛细管电泳分离片段。毛细管电泳根据片段的长度进行分离，并将不同长度的片段显示为峰值模式，称为电泳图。

六、数据分析

每个探针上的填充序列不同，每个扩增子都有不同的已知大小，因此在数据分析过程中可以对每个扩增子进行量化。毛细管电泳得到的数据将作为分析的输入，输入数据分析软件Coffalyser。通过将每个样本与一组参考样本进行比较，我们可以得到一个探针比，这个探针比率将告诉我们一个基因有多少个拷贝数。由于大多数人类基因是二倍体，如果样本有两个拷贝，比例将为1.0，即样本探针获得的基因数量与参考样本相同。如果比值为0.5，则该基因在个体中只有一个拷贝，这可能意味着目标基因的杂合缺失。另一方面，如果这个比率是1.5，那么很可能存在一个基因的杂合复制。