细胞克隆形成实验是用来检测细胞增殖能力、侵袭性、对杀伤因素敏感性等项目的重要技术方法。

一、实验原理

接种细胞后，只有同时具有贴壁和增殖活力的细胞才会形成克隆。克隆形成率反映细胞的独立生存能力的强弱，用于评价细胞群体依赖性和增殖能力。克隆形成率与接种密度有一定关系，在进行测定时需要将接种的单个细胞分散为悬液，并直接接种在培养皿中进行持续一周以上的培养，并在此期间进行检查。当出现新的、由单个原始生长出来的完整几何结构时，则可以停止培养过程。

克隆形成依据采用的培养介质的不同，分为平板克隆和软琼脂克隆两类。

二、实验方法

1. 平板克隆实验（以6孔板为例）

（1）将处于对数生长期的细胞胰酶消化后，wanquan培养基（基础培养基+10%胎牛血清）重悬成细胞悬液，并计数；

（2）细胞接种：于6孔板培养板中各实验组接种400-1,000个细胞/孔（根据细胞生长情况确定，一般为700个细胞/孔）;

（3）继续培养到14天或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途每隔3天进行换液并观察细胞状态；

（4）克隆完成后，在显微镜下对细胞进行拍照，然后PBS洗涤1次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30-60 min，PBS洗涤1次；

（5）每孔加入结晶紫染液1ml，染细胞10-20 min；

（6）PBS 洗涤细胞数次，晾干，数码相机拍照（分别对整个六孔板及每个孔进行单独拍照）。

2. 软琼脂克隆实验

（1）配制1.2% 和0.7%琼脂，高压灭菌后，维持在42℃中使其不会凝固；

（2）将1.2% 琼脂与2×培养基混合，铺入6孔板作为下层胶，每孔1.5ml，37°C孵育30 min使之凝固；

（3）将制备好的单细胞悬液与0.7%琼脂充分混匀，加入6孔板作为上层胶，每孔1.5ml。待其凝固后，再在上面加入培养基，每3天更换一次；

（4）根据细胞的生长速度培养2~3周后显微镜下观察克隆大小，与平板克隆一样，每个克隆>50个细胞，显微镜拍照。若拍整个孔，每孔加入200μl氯化硝基四氮唑蓝（NBT）染色，37°C过夜，拍照。

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