Protein A/G 亲和层析法纯化单克隆抗体原理、步骤及注意事项
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目前约 70% ~ 80% 的抗体纯化使用 Protein A/G 亲和层析法。Protein A 与 IgG 的结合强度很大程度上依赖于该抗体的种属和亚类,而 Protein G 对于大多数哺乳动物的 IgG 则有着更高的亲和力,因此,Protein G 可用于纯化不能与 Protein A 很好结合的哺乳动物单抗或多抗 IgG 的纯化。
原理
Protein A/G 亲和层析法纯化单克隆抗体的基本原理是 Protein A/G 能特异性地与抗体的 Fc 段结合,因此 Protein A/G 亲和层析柱可用于抗体(单抗和多抗)的分离纯化,具有很高的选择性。经过一步亲和层析,即可从腹水、杂交瘤培养上清或免疫血清等样品中得到高纯度(> 95%)的抗体。
材料与仪器
器材:
Protein A/G 亲和层析柱,FPLC 层析系统
试剂:
上样缓冲液:0.02 mol/L PBS,pH 7.4
洗脱液:pH 3.0~4.0、0.02 mol/L 柠檬酸缓冲液或 pH 3.0、0.2 mol/L 甘氨酸 -HCL 缓冲液
再生液:0.1 mol/L 乙酸
步骤
Protein A/G 亲和层析法纯化单克隆抗体的基本过程可分为如下几步:
A. 样品预处理:小鼠腹水于 4 ℃、12000 r/min 离心 15 分钟,以除去较大的凝块。经上样缓冲液倍比稀释后,0.45 μm 滤膜过滤。
B. 平衡:以 1 mL/min 的流速,用 5-10 倍层析柱体积的上样缓冲液平衡层析柱,至流出液 pH 值为 7.4。
C. 上样:预处理过的腹水上层析柱,保持 1 mL/min 流速,继续用上样缓冲液流洗 5~10 倍层析柱体积至基线稳定(即杂蛋白wan全洗脱)。
D. 洗脱:用洗脱液洗脱柱结合抗体,同时应用 FPLC 层析系统进行实时监测,当观察到基线开始上升,即出现洗脱峰时,每管 3 mL 收集流出液,直至洗脱峰回到基线,并立即用 1.0 mol/L pH 9.0 的 Tris-HCL 缓液调整收集的各管流出液 pH 值至 7.0。
E. 再生:保持 1 mL/min 流速,用 3~5 倍层析柱体积的再生液淋洗柱子。
F. 平衡:继续用 5~10 倍层析柱体积的上样缓冲液重新平衡层析柱,至流出液的 pH 呈中性,再用 10 倍层析柱体积的三蒸水平衡,可重复使用。
G. 浓缩:合并调至中性的各管洗脱液,采用超滤离心管进行浓缩,最后以 0.15 mol/L PBS(pH 7.4)调整到合适体积,进行 SDS-PAGE 鉴定纯度,BCA 法进行抗体定量,分装冻存。
注意事项
1. 纯化前所有缓冲液、样品及层析柱都必须平衡至室温,以避免产生气泡。
2. 纯化前样品、缓冲液须用 0.45 μm 滤膜过滤去除颗粒性物质,以防层析柱被堵塞而降低纯化效果。
3. 使用经饱和硫酸铵粗纯的样品不仅可获得更好的纯化效果,还可适当延长亲和层析柱的使用寿命。
4. 加样后,让样品在亲和柱内滞留一定时间(约 30 分钟)可提高亲和柱的纯化效率。
5. 在酸性条件下洗脱的抗体必须立即中和到中性(pH 7.0 左右),以利于维持抗体的生物学活性,避免抗体失活。
6. 在使用和保存层析柱时,应避免柱内液体流干,以防气泡进入。
7. 为确保层析柱的使用寿命和载量,及时清洗非常重要,清洗完成后用上样缓冲液重新平衡。
8. 层析柱可于 4 ℃、20% 乙醇中长期保存。
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