脂质-配体相互作用工具:脂质不再是可怕的中间体
时间：2023-09-08 阅读：1406
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当细胞生物学家第一次发现可能有一种脂质参与他们最喜欢的途径时，这有点像在马路对面找到一堵墙(就像当脂质学家在他们的路上找到一种蛋白质一样……)。
由于脂质的不同性质，大多数细胞生物学家都害怕在他们的研究过程中不得不面对这种情况。好消息是，有一些简单的方法可以帮助克服这一障碍，使研究特定途径中的脂质变得更容易。在这里，我想介绍一些脂配体相互作用研究的分析和准备工具。
1 覆盖试验Overlay assays-鉴定与给定蛋白质相互作用的脂质
这些分析方法允许鉴定一种或多种脂质与给定蛋白质相互作用。
与Western-blot原理类似，它们的原理是在表面涂上各种类型的脂质，这些脂质将与已知的蛋白质接触，这种蛋白质将被标记或抗体临时检测到。脂质的载体通常是硝化纤维素膜(图1)。与点印迹法一样，需要优化一些实验参数(如缓冲液、蛋白质纯化或蛋白质浓度)。
当可用蛋白质的数量有，小的“覆盖分析格式”可以用少于0.5 mg的蛋白质进行检测。这是一种简单的方法来测试一种感兴趣的蛋白质对各种脂质的结合能力!
为了检查蛋白质对各种类型的脂质的相对亲和力，硝基纤维素阵列被标记为每种脂质的梯度。几个相同的阵列可以证明在测试单特异性或多特异性蛋白质有用。该技术显示出高特异性(图2)，结果甚至比ELISA试剂盒更干净，再次强调了实验条件优化的必要性。
对于那些对膜不熟悉的人，或者正在研究大量蛋白质的人，也可以使用聚苯乙烯板，用各种类型的脂质共价涂覆(称为COVA板)。用于高含量筛选的微阵列板格式允许您在单个板上测试具有不同脂质的几种蛋白质(亲和性)。平板的每孔都有9种不同的脂质，用于检测先前标记或通过免疫检测的蛋白质。图3所示的是一个蛋白质结构域(已知与两种不同的脂质相互作用)。对于前面介绍的设置，需要优化蛋白质浓度。
2 下拉试验Pull-down assays-发现一种已知脂质的蛋白质伙伴
对于相反的实验设置，当您想要识别已知脂质的蛋白质伴侣时，琼脂糖为基础的下拉试验等制备技术将是您的选择:
*琼脂糖珠包被确定的脂质可以被进一步孵育与细胞裂解液，上清液，重组蛋白…
* 然后相互作用的复合体通过离心将它们拉下来。
它允许分离脂质结合蛋白的数量适合进一步鉴定和表征。它经常与细胞裂解液一起用于“捞出”脂质对偶物(图4)。
3 漂浮试验Floatation assays-用于更高特异性的蛋白质-脂质相互作用
当你在寻找更高特异性的蛋白质-脂质相互作用时，另一种基于脂质富集脂质体(用作脂质/配体相互作用的基质支持)的制备方法是可用的。
与GEM脂筏提取(葡萄糖梯度超离心)类似，脂质体预结合到脂质配体上，将沿着超离心制备的葡萄糖梯度分成几个部分分布(图5)。
这些富脂脂质体有许多优点:
*聚脂质体PolyPIPosomes是聚合的脂质体，
*增加稳定性(长达6个月)，
*生物素标签，方便链霉亲和素检测，
*尺寸均匀(~200 nm)，可进行浮选试验，
*这些脂质体也可用于:表面等离子体共振，脂质体覆盖分析，ITC。
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