液相色谱柱

液相色谱仪的系统由储液器、 泵、 进样器、 色谱柱、 检测器、 记录仪等几部分组成。 储液器中的流动相被高压泵打入系统 , 样品溶液经进样器进入流动相 , 被流动相载入色谱柱 (固定相 ) 内 , 由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数 , 在两相中作相对运 动时 , 经过反复多次的吸附 - 解吸的分配过程 , 各组分在移动速度上产生较大的差别 , 被 分离成单个组分依次从柱内流出 , 通过检测器时 , 样品浓度被转换成电信号传送到记录仪 , 数据以图谱形式打印出来。

原理结构

[1]液相色谱柱的结构:

a 、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成

柱接头采用低死体积结构,柱接头是两端螺纹组件,一端是为 7/16英寸内螺纹,另一 端是 3/16英寸的内螺纹 (国内外已规范化 ) 。 7/16英寸内螺纹与 1/4英寸柱管 (Φ6.35mm) 连 接,中间放置压环用于密封。 3/16英寸的内螺纹与 1/16英寸 (Φ1.57mm) 的连接管连接,中 间也放置压环用于柱接头的密封。 为了尽量减少柱外死体积, 在安装色谱柱时, 用 Φ1.57mm 连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底, 然后再拧紧空心螺钉。 压环被空心螺钉挤压变形 后紧箍在连接管上 (连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在 2. 5mm 长或其他固定尺 寸 ) 。

在两端柱接头内, 柱管两端各放置一片不锈钢滤片 (或滤网 ) , 用于封堵柱填料不被流动 相冲出柱外而流失。空柱各组件均为 316L 不锈钢材质,能耐受一般的溶剂作用。但由于含 氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性, 故使用时要注意, 柱及连接管内不能长时间存留此类溶 剂,以避免腐蚀。

b 、柱填料:

液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的,柱子的分类是依据填料类型而定。 正相柱:多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种,其颗粒直径在 3— 10 μm 的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合— CN , -NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。 反相柱:主要是以硅胶为基质,在其表面键合十八烷基官能团 (ODS)的非极性填料。也有无 定型和球型之分。

常用的其他的反相填料还有键合 C8、 C4、 C2、苯基等,其颗粒粒径在 3— 10 μm 之间。 填充剂的要求

常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。 反相色谱系统使用非极性填充剂, 以十八烷基 硅烷键合硅胶为常用, 辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶 (如氰基键合硅烷和 氨基键合硅烷等)也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂, 常用的填充剂有硅胶等。 离子 交换色谱系统使用离子交换填充剂; 分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂; 对映异构体的分离通常使用手性填充剂。

填充剂的性能(如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量 和键合类型等)以及色谱柱的填充,直接影响供试品的保留行为和分离效果。孔径在 15nm (1nm=10Å) 以下的填料适合于分析分子量小于 2000 的化合物, 分子量大于 2000 的 化合物则应选择孔径在 30nm 以上的填料。除另有规定外,分析柱的填充剂粒径一般在

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3μm~10μm 之间。粒径更小(约 2μm )的填充剂常用于填装微径柱(内径约 2mm ),使用 微径柱时, 输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配;如有必 要, 色谱条件也需作适当的调整。 当对其测定结果产生争议时, 应以品种正文规定的色谱条 件的测定结果为准。

温度的要求

以硅胶为载体的普通键合固定相的使用温度通常不超过 35℃,为改善分离效果可适当提高 色谱柱的使用温度,但不能超过 60℃。

流动相的要求

流动相的 pH 值应控制在 2~8 之间。当 pH 值大于 8 时,可使载体硅胶溶解;当 pH 值小 于 2 时,与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用 pH 值大于 8 的流动 相时, 应选用耐碱的填充剂, 如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶填充剂、 包覆聚合物填充剂、有机 -无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等;当需使用 pH 值小于 2 的流 动相时, 应选用耐酸的填充剂, 如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二 异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶填充剂,或有机 -无机杂化填充剂等。

注意事项

色谱柱的柱效和保护柱

拿到一根新柱时,一定要先看其使说明,然后测柱效,定期检测柱效, 保留在新色谱 柱上得到的色谱图,并记录条件, 定期检测仪器的谱带展宽。 若应用于在线监测, 应对 色谱柱提供在线的物理保护和化学保护, 例如采取安装在线过滤器, 自装填料保护柱和预 装保护柱等。在线过滤器的作用是防止颗粒在柱头累计,优点是基本不影响柱效, 在需要 高柱效的时候常用, 常更换的消耗品是滤芯和垫圈保护柱的作用是防止柱子被化学污染。 缺点是多数保护柱影响色谱柱的柱效, 特别是在用微柱时, 常用的是普通 自装填料的保护 柱。近新出的一些保护柱例如 S e n t r y — g u a r d保护柱, 它的特点是高质量、 高 效填料、 增加分析柱效、 对脏样品载荷能力大 , 能延长保护柱的寿命,手可拧紧接 头,安装时不需要工具, 省时省, 可换芯式设计, 能采用各种不同的填料, 主要适用于 非常脏非常复杂的样品本底, 例如生化样品, 环境样品和食品等, 或者不想做太多的圃相 萃取,不想降低柱效果等情况。

色谱柱的清洗

对所做的样品要有充分的了解,用对该样品洗脱能力zui强的流动相清洗,对于硅胶柱, 先用甲醇洗去极性杂质,然后用干燥的二氯甲烷和正庚烷 1 0 0 — 2 0 O r aL依次活化, 对于键和相柱, 一般用甲醇一甲醇一水依次冲洗, 每种色谱柱有特定的清洗方法, 一 定要看其使用说明

色谱柱的存放

存放前除去杂质和盐,采用合适的存放溶剂, 避免色谱柱床的干枯,避免机械振动,防 止细菌生长,注意存放的温度。

故障排除

1、柱压过高

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可能是微粒堵塞. 柱床膨胀, 不可逆吸附, 细菌生长等造成的。 也有可能是系统反压问题, 例如阻尼器堵塞,进样器堵塞, 管路或连接口堵塞. 在线过滤器不干净, 压力传感器不 准确等。

2、柱效低

可能是色谱柱被污染、 过滤片部分堵塞、色谱柱内的死体积造成,例如流动相 p H值或者 组成不合适造成固定相损失。 流动相急剧变化造成固定相物理损坏, 机械振动造成固定相 产生裂缝,柱床收缩或干枯。

也有可能是仪器连接的问题, 认真检查进样器、检测器、 管路、 保护柱和在线过滤器等 是否连接好,也可能是色谱柱没有平衡好, 进样量过大等问题。

3、重复性差、不出峰、回收率低

可能是色谱柱被污染, 流动相 p H 值或者组成不合适造成固定相损失 , 样 品溶剂 不同 或样品本身不稳定, 固定 相极性过强或者流动相极性过弱. 或者发生非特异性吸附。也 可能梯度实验时平衡时间不足,温度波动, 流动相组成改变, 样品溶剂不同, 样品稳定 性不好,方法的开发不好, 缓冲液的酸碱度不合适或者缓冲能力不足。

直到管线内(由溶剂瓶到泵入口)无气泡为止 , 切换通道继续 Purge ,直到所有 要用通道无气泡为止。

10、 单击 Pump 图标, 出现参数设定菜单, 单击 Pump Control 选项, 选中 Off , 单击 Ok 关泵, 关闭 Purge valve。

11、单击 Pump 图标,出现参数设定菜单,单击 Setup pump 选项,进入 Pump 编辑画面,设 Flow :1.0ml/min。

12、单击泵下面的瓶图标,如图所示(以二元泵为例) ,输入溶剂的实际体积和 瓶体积。 也可输入停泵的体积。单击 Ok