TSHR及TRAb研究的实际应用
时间：2022-07-27 阅读：1106
促甲状腺激素受体(TSH Receptor,TSHR)在体内外场景中均具有广泛的应用。人抗TSHR单克隆抗体可用于TSHR自身抗体(TRAb)的检测，有助于自身免疫性甲状腺疾病的诊断和治疗。这些TSHR单抗中，以M22™代替现有检测法中的TSH是目前灵敏度和特异性*高的检测方法。目前实现商品化的M22™已作为世界卫生组织促甲状腺抗体的国际参考物质，用于TRAb检测方法的校准。
背景
早在1956年，Adams和Purves就shou次报道了甲状腺疾病患者血清中，存在与TSH不同的长效甲状腺刺激因子(LATS) [1]。当时研究发现LATS刺激甲状腺的机制与血清蛋白的IgG部分相关。1974年，RSR创始人Smith博士与Hall的联合研究证实了Graves病患者血清中这种因子实质上是特异性靶向TSHR的自身抗体（即TRAb），而TRAb对TSHR的刺激是造成Graves病患者甲状腺功能亢进的病因[2]。这一研究结果促进了第一代TRAb体外检测方法的发展，为自身免疫性甲状腺疾病(AITD)的辅助诊断和管理提供依据。
TSHR研究的下一个重要里程碑是1989 - 1990年，在四个独立实验室中克隆了TSHR基因[3-7]。这为TSHR单克隆抗体的体外制备提供更多基础。
2003年，Smith博士从一名Graves病患者的外周血淋巴细胞中，分离出促甲状腺激素受体单克隆自身抗体(称为M22™)[8]。随后发现的多种TSHR单克隆自身抗体中，按生理功能又可为两种阻断型单抗(5C9和K1-70)和一种刺激型单抗(K1-18)[9]。重组TSHR基因表达技术的发展，配合目前已发现的TSHR单抗，使TSHR富亮氨酸重复结构域(LRD)可与M22和K1-70的Fab片段结合为抗原抗体复合物，以结晶形式得以提取[10,11]。这为后续研究中TSHR LRD与两种不同效应的单克隆抗体间分子的相互作用提供助益[10,11]。
当前多项研究成果证实，体外环境中的小鼠胚胎干细胞可以通过TSH刺激，定向转化为功能正常的甲状腺滤泡细胞。这为长期接受激素替代治疗的甲状腺疾病患者，开辟了功能恢复性治疗的新前景[12,13]。我们在近期的研究中还建立了Graves眼病(GO)的小鼠模型[14]，并制备了具有热稳定性的TSHR LRD制剂，shou次解析了无配体的糖蛋白激素受体结构域的晶体结构（2.83 Å分辨率）[15]。这些重大的科学结果不断促进对AITD患者诊断、监测以及管理的改进。
TRAb的体外应用实例
如上所述，在Graves病发病机制中，患者血清中的自身抗体对TSHR的刺激起核心作用。因TRAb检测的重要性，TRAb的检测方法也历经了多代的发展：
一代检测：
液相检测法，利用血清TRAb可以抑制放射性I-125标记的TSH与TSHR相结合的特性，使用聚乙二醇将抗原抗体复合物沉淀[16]。该检测法是Graves病诊断的一个里程碑。在早期开展的生物检测法中，通常以刺激型抗体TSAB或TSH对表达TSHR的活细胞进行刺激，以其产生的第二信使cAMP作为检测标志物来间接检测TRAb。该试验法耗时较久且流程复杂，不适宜大规模检测。一代液相法作为替代方案改变了这一局面。
二代检测：
第二代检测改为固相检测法，样品中的TRAb与固定在ELISA微孔或塑料管上的TSHR相结合，随后与生物素或I-125标记的TSH反应实现检测[17]。固相检测法实现了非放射性同位素标记和检测自动化，与第一代检测法相比，提高了方法学的灵敏度和特异性。
三代检测：
在新的第三代检测中，以M22-生物素替代二代检测中的TSH-生物素，从而进一步提高了灵敏度和特异性[18]。与二代检测中TSH与TSHR间的结合相比，M22因其复合物不易解离，在TRAb的竞争抑制法检测中更具有优势。这一特性使配体在严格的洗涤步骤里保持紧密结合，使其更适合用于自动化检测系统。第三代TRAb检测目前在各地的各个平台上广泛应用。即使检测时长控制在半小时内，也能保持良好的灵敏度和特异性[18,19]。
TRAb的浓度通常以IU/L表示，单位定义参考了国家生物标准和控制研究所(NIBSC)提供的世界卫生组织(WHO)标准物质。该类物质通常用于TRAb检测方法的校准。第一代标准物质(编号90/672)源自一位患者的捐赠。随着第一代标准物质的耗竭，M22™的开发诞生了第二代国际标准物质(编号08/204)。在NIBSC 08/204标准物质中，每支安瓿的正常人血清中含有1 μg冻干M22 IgG。当前M22™已规模化投产，实现了从实验室研究向产业化生产的转变。（RSRTJ解读：保证了M22的产出及供应问题。）
TSHR的体外应用实例
用TSHR260-JMG55替换对应片段后的全长TSHR，无论是对TSH或M22的刺激信号反馈，还是结合Graves病患者的TSHR自身抗体时，耐热型TSHR均与野生型TSHR的性能表现接近[15]。这些试验均证实，耐热突变不影响TSHR本身的抗原性。
TSHR的体内应用研究
在目前的设想中，稳定的TSHR制剂可以对患者体内的血清TRAb特异性免疫吸附。在需要从患者外周循环中紧急清除TRAb的危急临床危重情况下，通过TRAb与TSHR260-JMG55结合的机制，将TRAb从患者血浆中分离，从而提供快速有效的治疗效果。
肿瘤治疗展望
在甲状腺癌的控制策略上也可提供新思路：通过一种含TSH片段的纳米脂质体，装载化疗药物后靶向到达病灶处的TSHR[24]。另一种方法基于TSHR结合碳纳米管，这种纳米管能将外部光能转化为热能，从而在局部杀死癌细胞[25]。此外，针对TSHR的小分子拮抗剂，通过抑制信号通路的方法来抑制甲状腺癌进展[26]。目前在Graves病患者的临床试验中，采用K1-70单次递增剂量给药，已开展涉及安全性、耐受性、药代动力学和药效学的I期临床研究（结果已于22年发表）。
K1-70药用化实例
一名患有Graves病、严重GO和局部晚期伴远端转移的高分化甲状腺滤泡癌的女性患者，曾接受了K1-70作为药物的药效观察[27,28]。给药前该患者GO临床活动评分(CAS)为6/7，复视，双眼突出量21 mm，伴水肿、眼睑肿胀、眼球运动时疼痛、眼睑红斑。她开始接受为期3周，个体化定制剂量的K1-70用药，旨在中和她体内高水平的促甲状腺刺激型自身抗体。第一次给药时TRAb为130 IU/L，甲状腺刺激活性>2000%。该患者同时服用乐伐替尼治疗甲状腺癌。患者反馈称在开始K1-70治疗后不久，她的眼部症状有所改善；CAS提高到0-1/7，双侧突出量改善为19 mm，可通过手术矫正复视。接受K1-70治疗期间，患者恢复了驾驶能力，GO一并转入稳定期。在乐伐替尼因副作用而停药期间，仅K1-70单独用药，也观察到肿瘤进展放缓。在持续K1-70治疗2年且剂量提高至120 mg/次时，该患者身上仍未观察到不良反应。
这些早期研究表明，用K1-70阻断TSHR活性的体内治疗方式，在控制Graves病、GO和甲状腺癌中甲状腺功能亢进上具有广阔的应用前景。
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参考文献：Furmaniak, J., et al. "Practical applications of studies on the TSH receptor and TSH receptor autoantibodies." Endocrine 68.2 (2020): 261-264.