Digital PCR workflow影响检测性能的各因素分析
时间：2022-09-08 阅读：819
转自：罗氏诊断生命科学公众号
小罗：大家好，本堂课小罗将带领大家继续学习数字PCR，分析一下Digital PCR workflow影响检测性能的各因素。
基于泊松分布将核酸样本分散到大量微孔或者液滴中（如图1），相较于qPCR而言，dPCR无需标准曲线（如图2），抑制成分被有效稀释（如图3），读取结果方式具备更精确结果的潜力。尽管有诸多优势，我们仍需重视dPCR的操作过程、试剂耗材稳定性及硬件性能带来的影响；同时需针对性的完善实验细节，从而尽可能减少引入的偏差，获得高灵敏度、高稳定性的实验结果。
图1.dPCR实验原理图例
（来源：罗氏诊断整理）
图2.无需依靠通过标准品绘制的标准曲线
（来源：罗氏诊断整理）
图3.将样本分散到微孔后可以降低体系抑制成分的抑制效果
（来源：罗氏诊断整理）
完整的数字PCR操作流程：
取样过程：
a.
绝大多数生物学实验在取样过程中会引入取样偏差，因此在此操作过程中应尽量保持取得样本的操作一致，并且在不提高抑制物浓度的条件下，应尽量增大取样体积，选取低吸附样本管的耗材。
针对样本本身，如果是全基因组核酸进行数字PCR研究则需要进行片段化处理。细菌，病毒等样本通常需要结合多重靶标检测，实验设计时需分析靶点序列在基因组上的物理距离，并针对性的设计靶点引物或酶切干预来减少后续结果中出现的多靶标连锁问题。
体系配置：
b.
此步骤主要涉及移液偏差。dPCR仪器移液步骤越多，误差越大，因此在此操作过程中尽可能减少移液次数，同时选择校准过的靠近量程的移液器结合合适的低吸附枪头（如图4）。
移液操作通常为反向移液，对于低浓度样本尽可能增加重复以防止低分子随机性因素导致结果不稳定，高浓度探针引物稀释后移液可以减少批间误差。以手动单道移液器为例（如图5），同样是移取20 μl液体，选择量程是20 μl的移液器时精度≤±0.8%，换算成体积为±0.16μl；而选择量程是200μ的移液器时精度为≤±6%，体积偏差在±1.2μl 。
图4.dPCR加样时吸头角度
（来源：罗氏诊断整理）
图5.针对不同量程移液器移液过程的误差数据
（来源：罗氏诊断整理）
分散过程：
c.
有效反应单元数量是影响结果准确性和精确性的重要因素（如图6）。以泊松分布为基础来测算核酸浓度，需要在精度和动态范围之间取得平衡。相同反应单元下，精度要求越高，动态范围越小，精度要求越小，动态范围越大，因此提高有效反应单元数量，可同时提高精度和动态范围。
图6.20k,28k,100k微孔数目下，芯片孔越多，计算核酸浓度的准确性越高
（来源：罗氏诊断整理）
在反应单元一致的前提下，样本体积越大，越有利于低拷贝基因的检测。
分散过程中的误差分析：统计学样本浓度均值λ，即平均一个分区单元包含λ个拷贝不一定刚好是真实模板浓度，需要结合置信区间和置信水平表示,数字PCR中置信水平通常是95%，而针对置信区间科研和商业化公司有多种计算方式。
▷▷▷绝对定量误差分析，见图例CI区间（如图7）。
图7.dPCR绝对定量结果CI统计区间
（来源：罗氏诊断整理）
▷▷▷CNV误差分析更为复杂，需要目标基因和内参基因浓度比ratio值及相应的联合置信区间进行表示，见图例CI区间（如图8）。
图8.dPCRCNV结果CI统计区间
（来源：罗氏诊断整理）
信号采集：
d.
信号采集过程中荧光粉尘、交叉污染，都会影响正常阴阳单元的判定，可通过在超净台操作有效降低前者的影响。后者往往对反应单元的信噪比和单元间隔绝性有比较高的要求（如图9），原理上微滴法很难控制微滴间干扰和液滴融合等问题，相较而言以芯片为反应单元的数字PCR设备可以通过提高微孔工艺进而解决此类问题。
图9.孔之间应有较大间隔，可以避开孔之间的交叉干扰，获取更好的信噪比
（来源：罗氏诊断整理）
1D,2D结果中阈值的判读也是影响最终结果的重要因素。由于试剂耗材组分、非特异性扩增、探针引物二聚体等现象，导致背景噪音更为明显，导致阴阳性孔间阈值难以划分（如图10）。优化探针引物序列和配比、摸索合适的退火温度、配合低背景芯片耗材（如图11），同时结合硬件，比如结合使用高分辨率的光学检测系统、高性能的PCR温控系统可以有效提高信噪比，使阈值能够准确划分。
图10.1D图阴性（蓝色）与阳性（红色）信号应考察聚集度、信噪比、有无Rain等指标
（来源：罗氏诊断整理）
图11.芯片标准化的六边形微腔
（来源：罗氏诊断整理）
以上就是数字PCR实验流程常见的几类问题和参考性的解决方案。我们在实验中面对小分子样本的随机性，虽然无法超越不确定性极限达到确定，但通过细节把控和数据优化，使我们可以通过高效的方案进行实验。
*MC-CN-02168 有效期至2025年5月16日
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