实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

实时荧光定量PCR工作原理：此次介绍荧光染料法，目前常用的荧光染料是SYBR Green I，是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。

在学习实时定量PCR数据处理之前，我们首先需要了解一下它的数学原理，Ct值为什么是我们数据处理过程中的一个关键的因素。这两个图显示的是实时定量PCR的一组结果。上图是原始的线性图谱，下图则是处理过的指数图谱，但是它们两者表示的是同样的意思。x-轴表示PCR 循环数，y-轴表示扩增反应的荧光值，也就是扩增产物的量。这个图中有基线、阈值、Ct值这几个概念，从这几个值我们能够最终得到模板中目的基因的含量。

（1）那么什么是基线？如红色框所指，基线就是扩增曲线中的水平部分。在反应最初阶段，虽然产物是指数级增长，但是由于总量太少，其荧光处于背景水平，检测不到荧光增加。因此基线信号的产生是由于测量的偶然误差引起的。然而当累积了足够的扩增产物，足以产生可检测的荧光信号时，这个信号的值就被称为阈值，如红色箭头所指。通常阈值默认为基线信号的标准偏差×10。在阈值的前后，PCR的反应仍然是指数级增长的，因此此时的PCR结果可靠，可以准确地反映体系中模板的初始量。Ct值是信号强度达到阈值时所需要的循环数，也就是扩增曲线与阈值的交叉点，如图中的红点所指。

（2）我们可以看到图的右边显示了扩增曲线的4个阶段：基线期、指数增长期、线性增长期和平台期。其中在基线期和指数增长期，扩增产物都是以指数级增长的，但是在基线期我们没有办法检测；而到了线性期和平台期之后，由于不同基因，或者不同条件下其扩增效率差别很大，因此没有办法计算模板的含量。因此，在指数增长期的Ct值就成为了计算模板含量的一个关键值。

（3）那么，为什么知道了Ct值就能够得到最初的目的基因含量呢？图中表示一个基因的单次反应扩增曲线。上面这个公式计算的是扩增产物的分子数N，它等于模板的分子数乘以1+扩增效率的n次方，n代表循环次数。也就是说，如果扩增效率为100%，产物分子数就等于模板数乘以2的n次方。但是显然，在线性增长期和平台期，扩增效率不可能是100%，因此上述PCR理论方程只在指数期成立，也就是绿色框的部分。