样本标记/追踪与质控在大规模新一代测序 项目中的必要性与技术方案
时间：2017-08-31 阅读：3148
随着医学项目在*范围内的不断开展，基于新一代测序（NGS）技术的大规模基因组数据采集已经成为重要的研究手段之一。在此基础上建立起来的大数据平台，辅以、全面的健康和医学数据，将为疾病的诊断与治疗，药物的研发与个体用药，人群的健康保障等临床与转化医学研究带来极大的推动。
在大规模人群中开展NGS测序工作时，样本的准确性、可溯源性将会对zui终的大数据质量产生不可忽视的影响。由于NGS测序流程的复杂性（参见下图，NGS测序工作经典流程），在样本库内得到准确标记的样本，在测序流程中仍然有一定几率会发生混淆或者污染。根据上大型测序中心的估算，随着测序样本量的增加，一个操作流程完善、工作人员受过专业培训的基因检测实验室，仍然有可能产生千分之一左右的样本偏差。
因此，一种准确有效却又成本低廉的样本标记与追踪手段，在大规模NGS测序工作中具有重要的现实意义。在美国ACMG（美国医学遗传学与基因组学学院）发布的“临床实验室NGS测序标准”中指明：“相关实验室必须采取措施，避免样本混淆，并能够随时追踪与确认zui终结果”。2017年3月，中华医学会病理学分会发布的“临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识”中进一步阐明：“为确保检测过程中样本没有混淆或污染，可选用多个SNV位点或其他标签作为样本身份标识（sample ID），在检测前对每个样本进行SNV位点信息的测定，在NGS检测后对上述位点进行追踪，证明没有交叉污染”。
同时，一个大型测序数据库中面临的样本种类较为繁杂，其中与肿瘤相关的样本类型如石蜡包埋切片（FFPE）中提取的DNA、血浆中提取的循环肿瘤DNA等，均在正确标记、追踪之外，还需在NGS文库制备之前，对其中DNA片段降解程度进行有效评估，从而防止质量较差的样本带来的测序成本损失。
技术方案：
样本标记与跟踪目前的主要方案，是从待测序列（全基因组、全外显子组、靶向片段等）中选择若干标志性单碱基核苷酸变异（SNV），在样本入库及测序前，进行基于这些位点的等位基因分型，从而确保样本的收集与使用流程中没有发生混淆。在测序完成后，再次利用之前这些位点的基因数据，与测序结果进行再次验证比对，如果信息一致，即可确认样本正确性，以及测序覆盖范围与数据质量均达到标准。
为达到足够的区分效果，SNV需要满足以下两点标准：1）在待检测人群（中国人群）中具有较高的杂合度与区分力；2）需达到一定数量（30-40个）以在大规模样本库中仍可区分所有个体样本。根据这两点标准，国内外*人类基因组测序中心Broad Institute与华大基因均采用了美国Agena Bioscience公司基于核酸质谱MassARRAY®开发的样本标记/追踪技术。
该技术是利用MassARRAY®可以在一个反应中完成40多重SNV分型的特点，根据不同测序项目目标片段，选择约40个SNV位点（包括性染色体标记位点，用于追踪样本性别信息），并加入用于样本降解程度评估的片段完整性内参标记，在同一次反应中，同时完成对样本的标记与质控，随后以报告软件自动生成检测结果，并整合进入样本库相关数据。
根据样本库与数据库规模，MassARRAY®平台可采用384格式。在一天内，该平台可完成对6张384孔芯片（即2304个样本）的标记/追踪与质控。
利用MassARRAY®强大的定制功能，对不同的测序项目可以选取不同的SNV位点，整合为新的检测组合，因此具有更高的灵活性与针对性。