在制作原代细胞免疫荧光时，容易出现一些问题，造成荧光鉴定失败，将抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）时，一定要注意抗体的比例高低和浓度。

制作免疫荧光常用的方法有：

方法一：直接法

步骤：将荧光标记的特异性抗体（抗原）直接加在抗原（抗体）上，经一定的温度和时间染色，水洗—干燥—封片—镜检

优点：操作简便、特异性高、非特异性染色少

缺点：敏感性低

方法二：间接法

步骤：先用已知未标记的特异性抗体（一抗）与抗原反应，再用标记的抗体（二抗）与其反应，形成抗原—抗体—抗体复合物，水洗—干燥—封片—镜检

优点：敏感性强，目前多采用间接法

缺点：操作复杂

实验过程中常见的问题：

1，整个细胞片都出现荧光高点

原因有二：一是二抗浓度过高，适当降低二抗浓度即可。二是二抗发生沉淀，可以使用过滤或者离心荧光标记二抗

2，信号弱或无信号，染色细胞过少

目标蛋白在细胞中没有表达，需要制备细胞裂解液，用Western   Blotting验证目标蛋白在细胞中是否表达。

表达目标蛋白的细胞过少，标本中使用更多的细胞，试用其他瞬时转染方法，或者使用稳定转染细胞系。

细胞通透性差，需要增加通透剂作用的时间或者浓度，或改用其它的通透剂

染色前的固定步骤破坏了抗原表位，改用其他固定方法。

通透使抗原丢失，可以减少通透剂作用的时间或强度。

抗体不识别，需要换用其他抗体

一抗稀释度过大，使用同一样品按*的二抗用量作一抗稀释曲线，以确定*的一抗稀释比例。

二抗选择错误，要使用正确的二抗

3，镜下观察只有DAPI的蓝光，目的荧光几乎没有或者很弱

出现这种现象很有可能是抗体比例太低，需提高抗体浓度，可配合提高二抗浓度；共聚焦的激发荧光强度不够大；二抗孵育时是否是对应的种属，比如本来需要山羊抗鼠结果加为山羊抗兔。

4，细胞核周围总是存在有一些蓝色的小点点

这种情况一般是支原体污染所致，建议用杀支原体药2周后再检测，或者通过提高共聚焦机器背景值来覆盖支原体荧光

5，如何共定位的视野

共定位时，首先判断哪些细胞是转染成功的，比如我过表达了蛋白A，想做蛋白A和蛋白B的共定位关系，则在视野中寻找已成功转染蛋白A的细胞，一般荧光强度会显著高于周边其他细胞，再在这个细胞上观察蛋白B的表达。

6，视野中细胞与细胞之间存在散在的发光点

有两种情况可造成：1，拍照时PBS量过少引起的非特异性；2，PBS未过滤，未溶解的残渣黏附而导致

三、除此之外，这些注意事项也要牢记

1、合适的抗体稀释比例

通过优化抗体稀释比例来优化染色，通常情况下1ug/ml的纯化抗体或者1:100-1:1000的抗血清足够达到特异性染色的结果。但在能保证低背景染色的前提下，可以通过增加浓度来提高信号强度。如果是*次使用该抗体或测定某抗原，强烈建议浓度梯度实验。

2、抗体特异性

免疫荧光需要用到特异性非常强的抗体，可以避免高背景和不理想的蛋白定位结果。在大多数情况下，纯化抗体的效果很好，但是正确的对照可以帮助定位抗原。使用只有二抗染色的片子

3、细胞固定和通透

为达到*的检测效果，细胞需要经过固定和通透。这些步骤非常关键，细胞和抗原需要保证*的结构，并利于抗体与抗原结合。通常情况下，需要通过以下步骤得以实现：细胞用2%-4%多聚甲醛固定，之后用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100进行通透。前者是比较温柔的处理，但是对于核内抗原可能无效，需要用到Triton。使用皂角苷进行通透时，要注意它会引起细胞膜的可逆性通透，也就是除了在通透初期，在每个抗体孵育环节都需要进行通透。另外，细胞可以用冰甲醇进行同时固定和通透，可以避免去垢剂的使用。

4、封闭条件的优化选择

为了防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前用封闭液封闭，这样可以减少非特异性的背景着色。封闭液可以选择二抗来源一致的血清，一般来说，血清价格比较昂贵，可以用1%-5%BSA替代，BSA可以说是的封闭血清。另外封闭时间不易过长，30-60min即可，且封闭后不用洗涤，直接加一抗孵育即可。

5、一抗二抗的选择

封闭过后需要一抗孵育，可以选择4度过夜孵育或者室温3h，以笔者的经验是一抗孵育4度过夜比较好，抗原抗体结合会比较充分。一抗二抗的稀释比例可以根据抗体说明书来，再根据自己具体的实验要求进行优化。如果抗体浓度过低，会造成信号太弱，如果抗体浓度过高可能会造成背景染色太强。荧光二抗个人感觉Alex flour荧光基团信号强于Dylight强于FITC。如果做免疫双标，一抗要来自不同种属，荧光二抗的光谱也要分开。