小鼠支气管平滑肌细胞的分离培养方法
时间:2019-12-27 阅读:1732
平滑肌即无纹肌的通称,平滑肌是由长纺锤形的单核细胞构成。它不构成独立的器官,而只是成为构成体壁和内脏壁的因素(肌层)。平滑肌细胞互相连接,形成管状结构或中空器官;在功能上可以通过缩短和产生张力使器官发生运动和变形,也可产生连续收缩或紧张性收缩,使器官对抗所加负荷而保持原有的形状。
小鼠支气管平滑肌细胞的收缩、舒张、增殖和凋亡与临床许多疾病的病理生理过程有关.如支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病等。例如在哮喘发病时,可以检测到气管平滑肌发生数目的增生和肥大,表型也发生改变,由收缩型转为合成型与分泌型,并分泌多种与细胞因子;而且出现向气管腔迁移的迹象。
小鼠支气管平滑肌细胞来源于实验动物正常支气管组织,长梭状细胞,贴壁培养。通过平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫荧光染色鉴定为阳性,鉴定纯度高于90%,不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。
1.试验所需仪器设备及试剂
(1)仪器
仪器名称 | 规格型号 | 厂家 |
生物安全柜 | BSC-1500ⅡA2-X | 济南鑫贝西生物技术有限公司 |
CO2细胞培养箱 | BC-J160S | 上海博迅实业有限公司 |
荧光倒置显微镜 | DS-Ri2 | Nikon |
高速冷冻离心机 | Multifuge X1R | Thermo Fisher |
电热恒温鼓风干燥箱 | DHG-9123A | 上海精宏实验设备有限公司 |
(2)试剂耗材
试剂名称 | 规格/货号 | 厂家 |
T25细胞培养瓶 | 430639 | Coming |
血球计数板 | Neubauer improved | Marienfeld |
细胞培养孔板 | WHB-24 | 上海卧宏生物科技有限公司 |
平滑肌细胞*培养基 | PriMed-iCell-004 | 镜像绮点(上海)细胞技术有限公司 |
0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA) | 1734858 | Gibico |
2.小鼠支气管平滑肌细胞的分离培养
1) 取4-5周龄的小鼠,断颈处死后,泡于75%的酒精中,
2) 剖开胸腔,取出完整气管及肺组织,放入无菌PBS中,
3) 在体视显微镜下,小心分离出下游支气管,
4) 用眼科剪及镊子分离肌层并剪碎,
5) 加入0.1% I + II + IV + dispase,4℃过夜消化,
6) 第二天置于37℃水浴摇床中消化2~3h,
7) 待液体变浑浊后加入*培养基终止消化,充分吹打,
8) 过100目筛网,收集滤液,1000rpm离心5min,弃去上清,
9) 用*培养基重悬沉淀,铺瓶。
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