说说人表皮永生化细胞HACAT的培养步骤。

　　1、复苏细胞：在37℃水浴中快速摇动装有1mL细胞悬液的冷冻管融化，加入5mL培养基并充分混合。在1000RPM下离心5分钟，弃去上清液，加入4-6mL*培养基并充分吹扫。然后将所有细胞悬浮液添加到培养瓶中，并培养过夜（或将细胞悬浮液添加到6cm皿中）并培养过夜。第二天换培养基，检查细胞密度。

　　2、细胞传代：如果细胞密度达到80％-90％，则可以传代培养。
 

　　对于贴壁人表皮永生化细胞HACAT ，传代可参考以下方法：

　　（1）弃去培养上清液，并用不含钙和镁离子的PBS冲洗细胞1-2次。

　　（2）向培养瓶中加入1-2ml消化液（0.25％胰蛋白酶-0.53mMEDTA），将其置于37℃的培养箱中1-2min，然后在显微镜下观察细胞的消化情况，如果大部分细胞旋转并掉落后，迅速将其带回手术台，轻敲培养瓶几次，并加入5ml以上含10％血清的*培养基终止消化。

　　（3）轻轻吹干细胞，然后将其*吸出。以1000RPM离心8-10分钟，弃去上清液，加入1-2mL培养基并充分吹扫。

　　（4）加入5-6ml/瓶培养液，然后将细胞悬液分成新的培养皿或瓶，其中装有5-6ml培养液的比例为1：2至1：5。

　　对于悬浮人表皮永生化细胞HACAT，传代可参考以下方法：

　　（1）收集细胞，以1000RPM离心8-10分钟，弃去上清液，并加入1-2mL培养基吹净，然后将细胞悬液分成新的培养皿或瓶，其中含有8ml培养基，比例为1：2至1：5。

　　（2）可以选择一半的介质更换方法。丢弃一半培养基后，悬浮剩余的细胞，然后将细胞悬浮液分成新的含有8ml培养基的细胞悬浮液，比例为1：2至1：3。在盘子或瓶子里。

　　3、细胞冻存：当细胞生长良好时，可以将其冷冻保存。将贴壁细胞冷冻保存后，弃去培养基并加入少量胰蛋白酶。细胞变成圆形并脱落后，通过离心收集它们。