猪骨骼肌卫星细胞永生化分离培养及鉴定、转染方法
时间：2024-05-15 阅读：491
骨骼肌细胞是人和动物体内最大的细胞之一，它们是由成肌细胞(Myoblasts)融合而来的多核细胞，故骨骼肌的形成是一个非常复杂的过程，并需要多种细胞信号通路的参与，包括phosphatidylinositol 3-kinase，calcineurin，STAT3和MAPK等。原代骨骼肌细胞的培养是研究细胞分化过程的有效的模型。
该细胞通过慢病毒转染的方式携带SV40基因。
细胞来源于正常动物肌肉组织，通过肌动蛋白（α-actin）免疫荧光染色鉴定为阳性，细胞纯度高于90%。细胞形态位梭形，不规则细胞，贴壁培养。
1.试验所需仪器设备及试剂
（1）仪器
仪器名称 | 规格型号 | 厂家 |
生物安全柜 | BSC-1500ⅡA2-X | 济南鑫贝西生物技术有限公司 |
CO2细胞培养箱 | BC-J160S | 上海博迅实业有限公司 |
荧光倒置显微镜 | DS-Ri2 | Nikon |
高速冷冻离心机 | Multifuge X1R | Thermo Fisher |
电热恒温鼓风干燥箱 | DHG-9123A | 上海精宏实验设备有限公司 |
电热恒温震荡水槽 | DK-2B | 上海精宏实验设备有限公司 |
（2）试剂耗材
试剂名称 | 规格/货号 | 厂家 |
T25细胞培养瓶 | 430639 | Corning |
血球计数板 | Neubauer improved | Marienfeld |
24孔板专用细胞爬片 | YA0350 | Solarbio |
细胞培养孔板 | WHB-24 | 上海卧宏生物科技有限公司 |
胎牛血清 | 1414426 | Gibco |
骨骼肌卫星细胞专用培养基 | Primed-iCell-018 | 赛百慷（上海）生物技术股份有限公司 |
0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA） | 1734858 | Gibco |
Collagenase Ⅰ | 17018029 | Gibco |
Collagenase Ⅱ | 17101015 | Gibco |
Collagenase Ⅳ | 17104019 | Gibco |
多聚甲醛（PFA） | P1110 | Solarbio |
DAPI | C0060 | Solarbio |
Triton X-100 | T8200 | Solarbio |
山羊血清 | SL038 | Solarbio |
Myod | 18943-1-AP | Proteintech |
CoraLite594 – conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | SA00013-4 | Proteintech |
Fluoromount-G荧光封片剂 | 0100-01 | SourthernBiotech |
2．猪骨骼肌卫星细胞的分离培养
1) 首先将猪颈部动脉放血致死。
2) 小心剪取后肢肌肉，剔除脂肪，筋膜，血管等，
3) 用PBS漂洗肌肉2-3次，
4) 将肌肉组织剪碎，
5) 加入3倍体积的0.1% Ⅰ+Ⅱ+Ⅳ型胶原酶4℃冰箱过夜消化，
6) 第二天，将混合液取出置于37℃水浴锅中震荡消化1h，
7) 过100目筛网，
8) 收集滤液，
9) 300g 离心5 min，
10) 重悬沉淀，铺瓶
细胞分离培养：
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原图见文件-细胞分离培养
3．免疫荧光鉴定
3.1实验步骤
（1）细胞爬片
取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培养基1mL，加入细胞0.02million个/孔。置培养箱2h或过夜。
（2）固定
细胞爬片后，吸出培养基，用PBS洗1遍，加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可最后一次不吸出PBS，放4℃过夜。
（3）破膜封闭
将玻片除去水分，置于培养皿支撑物上，
玻璃片封闭液配置：0.5% Trition X-100与PBS 1:1混合，再加10% 血清，
取50uL破膜封闭液滴于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上2h。
（4）一抗孵育
一抗配制：抗体与PBS 1:100（200）稀释
破膜封闭后，取50uL一抗于防水膜上（湿盒中），将玻片（有细胞的一面）盖上置于4℃（最多可放置一周）
（5）二抗孵育
室温避光孵育二抗（二抗:PBS=1:500）2h后，PBS洗3×5min/次，染DAPI（DAPI:PBS=1:1000）5min，PBS洗3×5min/次。
（6）包埋
玻片上各滴1滴Fluoromount-G，将有细胞的一面盖上。
鉴定细胞为P1代细胞
一抗为Myod
3.2免疫荧光鉴定结果
100X-DAPI 100X-Fluorescence
原图见文件-免疫荧光
4.转染
4.1SV40过表达慢病毒基本信息
实验信息表： | ||||
产品名称 | SV40过表达慢病毒 | |||
载体信息 | 载体元件信息 | EF1α-SV40-IRES-puromycin | ||
携带荧光标记 | GFP □ RFP□ | 抗性基因标记 | Puromycin □ Blasticidin □ | |
载体图谱 |
| |||
载体目的序列信息如下： gtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaggatctatttccggtgaattcatggataaagttttaaacagagaggaatctttgcagctaatggaccttcta ggtcttgaaaggagtgcctgggggaatattcctctgatgagaaaggcatatttaaaaaaatgcaaggagtttcatcctgataaaggaggagatgaagaaaaaat gaagaaaatgaatactctgtacaagaaaatggaagatggagtaaaatatgctcatcaacctgactttggaggcttctgggatgcaactgagattccaacctatgg aactgatgaatgggagcagtggtggaatgcctttaatgaggaaaacctgttttgctcagaagaaatgccatctagtgatgatgaggctactgctgactctcaaca ttctactcctccaaaaaagaagagaaaggtagaagaccccaaggactttccttcagaattgctaagttttttgagtcatgctgtgtttagtaatagaactcttgcttg ctttgctatttacaccacaaaggaaaaagctgcactgctatacaagaaaattatggaaaaatattctgtaacctttataagtaggcataacagttataatcataacat actgttttttcttactccacacaggcatagagtgtctgctattaataactatgctcaaaaattgtgtacctttagctttttaatttgtaaaggggttaataaggaatatttg atgtatagtgccttgactagagatccattttctgttattgaggaaagtttgccaggtgggttaaaggagcatgattttaatccagaagaagcagaggaaactaaac aagtgtcctggaagcttgtaacagagtatgcaatggaaacaaaatgtgatgatgtgttgttattgcttgggatgtacttggaatttcagtacagttttgaaatgtgttt aaaatgtattaaaaaagaacagcccagccactataagtaccatgaaaagcattatgcaaatgctgctatatttgctgacagcaaaaaccaaaaaaccatatgcc aacaggctgttgatactgttttagctaaaaagcgggttgatagcctacaattaactagagaacaaatgttaacaaacagatttaatgatcttttggataggatggat ataatgtttggttctacaggctctgctgacatagaagaatggatggctggagttgcttggctacactgtttgttgcccaaaatggattcagtggtgtatgactttttaa aatgcatggtgtacaacattcctaaaaaaagatactggctgtttaaaggaccaattgatagtggtaaaactacattagcagctgctttgcttgaattatgtgggggg aaagctttaaatgttaatttgcccttggacaggctgaactttgagctaggagtagctattgaccagtttttagtagtttttgaggatgtaaagggcactggagggga gtccagagatttgccttcaggtcagggaattaataacctggacaatttaagggattatttggatggcagtgttaaggtaaacttagaaaagaaacacctaaataaa agaactcaaatatttccccctggaatagtcaccatgaatgagtacagtgtgcctaaaacactgcaggccagatttgtaaaacaaatagattttaggcccaaagatt atttaaagcattgcctggaacgcagtgagtttttgttagaaaagagaataattcaaagtggcattgctttgcttcttatgttaatttggtacagacctgtggctgagttt gctcaaagtattcagagcagaattgtggagtggaaagagagattggacaaagagtttagtttgtcagtgtatcaaaaaatgaagtttaatgtggctatgggaattg gagttttagattggctaagaaacagtgatgatgatgatgaagacagccaggaaaatgctgataaaaatgaagatggtggggagaagaacatggaagactcag ggcatgaaacaggcattgattcacagtcccaaggctcatttcaggcccctcagtcctcacagtctgttcatgatcataatcagccataccacatttgtagaggtttt acttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacagagcaaaagctcatttctgaagaggacttgtaatctagacacagtgcagcactctcaacg ttcaaggacactacgcgtctggaacaatcaacc 黄色区域为目的序列区 | ||||
4.2转染
（1）将细胞接种6孔板，每孔细胞数约为1×105 个，
（2）第二天，待细胞贴壁后，换液，
（3）加入1mLwan全培养基，再加20 μL SV40过表达慢病毒，
（4）混匀后继续培养，
（5）12h后观察细胞状态，并更换为新鲜培养基，
（6）当细胞长满板底后，传代至T25培养瓶中。
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原图见文件-转染
5.筛选
5.1杀灭曲线的确定
（1）将未转染的细胞按每孔0.05million铺入24孔板，孵育过夜，
（2）第二天，除去24孔板中旧的培养基，
（3）将含不同浓度嘌呤霉素（1μg/mL，2μg/mL，3μg/mL，4μg/mL，5μg/mL，6μg/mL，7μg/mL）的新鲜培养基加入已铺有细胞的24孔板，
（4）每2天更换新鲜的筛选培养基，
（5）每天观察细胞的存活比例，
（6）最小的嘌呤霉素使用浓度就是从嘌呤霉素筛选开始1-4d内杀死所有细胞的zui低筛选浓度。
结果：嘌呤霉素的使用浓度为2μg/mL，作用时间为2d。
5.2嘌呤霉素筛选转染细胞
（1）第一天，将转染的细胞按每孔0.05million铺入24孔板，孵育过夜
（2）第二天，除去24孔板中旧的培养基，
（3）加入含嘌呤霉素（2μg/mL）的筛选培养基，孵育，
（4）每2天更换新鲜的筛选培养基，
（5）每天观察细胞的存活比例，
（6）在同一时间点（2d）存活的细胞，即为转染成功的细胞，
（7）对筛选后的细胞进行扩增。
6.细胞扩增
将筛选后的细胞进行扩增，筛选后的细胞为P1代，扩增至少到12代。
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