一、技术简介

外泌体是这几年开始兴起的一个朝阳领域，它是细胞分泌的一种直径在30-100nm（另一种说法是 30-150nm）的膜泡结构，可以介导细胞间物质的交换和信息通讯。有研究分为9个类别依次为：单囊泡、双囊泡、多膜泡、小双层膜泡、椭圆膜泡、小管、大管、不完整的膜泡、不规则膜泡，其中在不同类别的囊泡中可以发现三个附加特征：表面具涂层的膜泡、内含纤维的膜泡、电子致密囊泡。

相信大家对这些早已耳熟能详，在此不多做赘述。外泌体的分离是困扰刚刚进入该领域研究者的主要问题，从分离角度讲目前大家分离外泌体主要通过一下集中手段：差速超速离心法、梯度密度离心法、沉淀试剂盒、凝胶排阻分离法、膜亲和试剂盒等手段，后两者主要用于同时分离所有的胞外囊泡组分。以上诸多分离方法中，梯度密度离心的分离方法是*可以得到高纯度的分离方法，但是操作相对复杂，目前使用并不广泛。以目前的手段来说，我们很难拿到纯的外泌体组分，而多是以外泌体为主要组分的胞外微囊泡，在这里对两者不做过多区分。关于分离的一些经验技巧，朋友们可以参考 “外泌体之家” 分离鉴定板块的相关贴子，适时在以后的文章中会详细展开。

外泌体的鉴定是既分离后又一个困扰研究者的问题，一般研究者需要通过透射电镜观测样本中是否存在外泌体样结构（通常为茶托型或一侧凹陷的半球形），通过粒子直径分析系统测算和统计样品中粒子的直径分布，通过western blot检测样品中是否有外泌体相关marker蛋白的富集。另外，当电镜图观测到的样品结构不是典型外泌体样结构时，还需要增加免疫胶体金电镜进行验证。本文将通过纳米颗粒与外泌体电镜图像的对比来总结外泌体电镜图的鉴别方法，争取让大家明白为什么外泌体电镜需要看到具有膜结构的茶托样纳米粒子才能算是看到了外泌体。本司采取通过透射电镜确定外泌体大小。

二、实验流程

1. 外泌体戊二醛固定。

2. 清洗：用1mL PBS清洗3次，每次静置15min。

3. e酸固定：加入0.5 mL 2%e酸溶液 4度固定2h。

4. 清洗：用1mL PBS清洗3次，每次静置15 min。

5. 脱水：用50%、70%、80%、90%乙醇各1mL梯度脱水分别静置15min，再用1mL 100%乙醇脱水2次，每次20min。

6. 置换：用1mL丙酮置换2次，每次静置15min。

7. 浸渍。

8. 包埋：将样品放入盛有纯包埋剂的包埋板中。

9. 聚合：将包埋板置于65℃条件下聚合48h。

10. 染色：醋酸双氧铀染色 10min后清洗；醋酸铅染色 10min后清洗。

11. 上机检测。

12. 提供实验报告。

三、服务说明及结果

1. 客户提供：外泌体（30 μl）或由我司分离得到外泌体。

2. 公司提供：基本实验步骤、图片、数据分析结果。

3. 实验周期：10个工作日。